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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 12kb载体和5.3kb片段的大片段连接，求助！谢谢了~~~
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胡笳桃子

新虫 (小有名气)

[交流] 12kb载体和5.3kb片段的大片段连接，求助！谢谢了~~~

最近在做载体构建，遇到一个连接的问题，在此求助了！

12kb的载体，双酶切回收后浓度为150ng/ul；DNA片段双切回收后浓度为80-100ug/ml.

连接体系是这样的：
vector：2.5ul
insert:5ul
buffer:2ul
T4 ligase:0.5ul
ddH2O:10ul

转化后挑取转化子培养，提取质粒。

可是提了8管，经过酶切验证，发现统统都没有连上；只是把切开的载体转入
DH5a菌而已。

请问大片段的连接是不是有什么要求的？在此请教了！！！

谢谢
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赠人玫瑰，手有余香。
1楼 2009-04-10 23:13:30
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
什么公司的T4？
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2楼2009-04-10 23:16:59
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胡笳桃子

新虫 (小有名气)
自己顶顶
补充一下：载体是pCAMBIA1301，双切后直接用试剂盒回收的；DNA片段则是先克隆到pUC18后再双切进行切胶回收得到。二者浓度通过电泳后目测估计。

连接是在22度过夜，约12-16h。上海生工的T4.
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赠人玫瑰，手有余香。
3楼2009-04-10 23:30:42
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
没用过国产T4
我用TOYOBO ligation high Ver.2
NEB的T4
从来没失败过
均是半小时到一小时搞定连接，无需过夜
现在已经不流行过夜了……现在需要过夜的酶要对它的活性打个问号
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4楼2009-04-10 23:35:02
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胡笳桃子

新虫 (小有名气)
那请问我的连接体系需要改进吗？
或者，长片段的连接有什么特殊的要求或实验技术？
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赠人玫瑰，手有余香。
5楼2009-04-10 23:40:43
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wuyunzhou

银虫 (小有名气)
insert与载体的分子比最好为5：1
载体一定要跑长胶，彻底分开，与连入5千多的片段相比，自连更省事
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6楼2009-04-10 23:48:53
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胡笳桃子

新虫 (小有名气)
载体跑长胶？我是用试剂盒回收的，然后再取1ul跑电泳目测浓度。
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赠人玫瑰，手有余香。
7楼2009-04-10 23:52:28
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melodyxin

铜虫 (小有名气)
哎╮(╯▽╰)╭
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8楼2009-04-11 10:05:51
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muchong5577

金虫 (正式写手)
电泳后能目测浓度？ 好强大！请问能教教我们怎么目测吗？
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9楼2009-04-11 13:19:47
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
to楼上：
根据marker判断质量然后估算摩尔浓度


我感觉是酶不好的问题，国产的酶活性确实比较差劲
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10楼2009-04-11 13:39:11
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