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胡笳桃子

新虫 (小有名气)

[交流] 12kb载体和5.3kb片段的大片段连接,求助!谢谢了~~~

最近在做载体构建,遇到一个连接的问题,在此求助了!

12kb的载体,双酶切回收后浓度为150ng/ul;DNA片段双切回收后浓度为80-100ug/ml.

连接体系是这样的:
vector:2.5ul
insert:5ul
buffer:2ul
T4 ligase:0.5ul
ddH2O:10ul

转化后挑取转化子培养,提取质粒。

可是提了8管,经过酶切验证,发现统统都没有连上;只是把切开的载体转入
DH5a菌而已。

请问大片段的连接是不是有什么要求的?在此请教了!!!

谢谢
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)

没用过国产T4
我用TOYOBO ligation high Ver.2
NEB的T4
从来没失败过
均是半小时到一小时搞定连接,无需过夜
现在已经不流行过夜了……现在需要过夜的酶要对它的活性打个问号
4楼2009-04-10 23:35:02
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胡笳桃子

新虫 (小有名气)

自己顶顶
补充一下:载体是pCAMBIA1301,双切后直接用试剂盒回收的;DNA片段则是先克隆到pUC18后再双切进行切胶回收得到。二者浓度通过电泳后目测估计。

连接是在22度过夜,约12-16h。上海生工的T4.
赠人玫瑰,手有余香。
3楼2009-04-10 23:30:42
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胡笳桃子

新虫 (小有名气)

那请问我的连接体系需要改进吗?
或者,长片段的连接有什么特殊的要求或实验技术?
赠人玫瑰,手有余香。
5楼2009-04-10 23:40:43
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wuyunzhou

银虫 (小有名气)

insert与载体的分子比最好为5:1
载体一定要跑长胶,彻底分开,与连入5千多的片段相比,自连更省事
6楼2009-04-10 23:48:53
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