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12kb载体和5.3kb片段的大片段连接，求助！谢谢了~~~
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最近在做载体构建，遇到一个连接的问题，在此求助了！ 12kb的载体，双酶切回收后浓度为150ng/ul；DNA片段双切回收后浓度为80-100ug/ml. 连接体系是这样的： vector：2.5ul insert:5ul buffer:2ul T4 ligase:0.5ul ddH2O:10ul 转化后挑取转化子培养，提取质粒。 可是提了8管，经过酶切验证，发现统统都没有连上；只是把切开的载体转入 DH5a菌而已。 请问大片段的连接是不是有什么要求的？在此请教了！！！ 谢谢 |
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