12kb载体和5.3kb片段的大片段连接，求助！谢谢了~~~ - 生物科学

11楼2009-04-11 13:41:53

胡笳桃子

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双切啊

两个序列，分别双切，不是可以连起来吗？

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12楼2009-04-12 21:36:07

三磷酸腺苷

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那一次转化后的克隆数是不是很少呢？

13楼2009-04-12 22:44:01

胡笳桃子

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还好的，不算太少。

赠人玫瑰，手有余香。

14楼2009-04-14 21:50:04

wuyunzhou

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你的载体制备肯定有问题，有很多单切的载体混在双切的载体中，建议两次单切，分别胶回收，确定能把未切完全的载体去掉！！！

15楼2009-04-14 23:07:43

sunqx

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引用回帖:

Originally posted by 胡笳桃子 at 2009-04-10 23:13:30:
最近在做载体构建，遇到一个连接的问题，在此求助了！

12kb的载体，双酶切回收后浓度为150ng/ul；DNA片段双切回收后浓度为80-100ug/ml.

连接体系是这样的：
vector：2.5ul
insert:5ul
buffer:2ul
T4 li ...

您好，您的问题解决了吗？

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16楼2010-03-19 17:31:35

zjwang

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当时也遇到几乎和你一样的连接，一样的pCAMBIA1300,一样的5.3K，作了好久，只能一遍遍试了，调整比例。找个好点的酶和感受态细胞，祝福！

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17楼2010-03-19 18:02:40