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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 根据序列设计完引物，跑完胶测序一对比不完全吻合怎么办
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xydlengyue

金虫 (正式写手)

[求助] 根据序列设计完引物，跑完胶测序一对比不完全吻合怎么办已有3人参与

按照NCBI上找的序列设计的，但是引物送来PCR之后结果无法完全吻合
原序列：
AAAATAATATAAAAAAATAATAAATTAATTTCTTTATATATCATTTAGTTAATGGCGATTCTATAAAAAATCACAGAAAAATTTGTTGGAAAAGTTAAAGGTTGTATCTGGGGTGCCGATAAACTTGTTGCCGGTGATTGACACCGTAAATGAATAGGCAAACTTTTATTTTATCGACTTGATTTTAAAGGAATCTAGCTATGGCACAAGTCATTAATACCAACTATCTATCCCTGGTAACTCAAAACAACCTGAACAAATCTCAGGGAACTTTAGGAAGTGCAATCGAGCGTCTGTCTTCTGGTCTACGTATCAACAGTGCAAAAGACGATGCAGCGGGTCAAGCAATTGCTAACCGTTTCACTTCAAACGTAAATGGTTTAACTCAAGCTTCACGTAATGCGAACGATGGTATCTCTATCGCTCAAACAACTGAAGGTGCATTAAACGAAATCAACAATAACTTACAACGTATCCGTGAGTTAACTGTTCAAGCGAAAAACGGTACTAACTCTAATTCAGATATCACTTCTATCCAAAACGAAGTGAAAGAACGTTTAGACGAAATCAACCGTATTTCTGAACAAACTCAGTTTAACGGCGTGAAAGTACTGAGCGGTGAGAAATCAGAAATGGTTATCCAAGTTGGTACTAACGATAATGAAACTATCAAATTTAACTTAGATAAAGTTGATAACGATACATTAGGTGTTGCTAGCGATAAACTGTTTGATGCTAAAACAGAGAAAAAAGGTGTTACAGAAGCAGGTGCTGCAATCGATGCGAAAGATATCGGCGTTGCTGGTGCAACTTCATACGATTCAGGTACAGTAAAAGAATATAAAGTAGATGGTGTTGTTTCTGCTGATAAAGTAATTTTCAATGATGGTACTAAAGATTACCTCGTAAATAAAAGCGATTTCGCACTGGAAGGTGCTGACAAAGCTAAATTTACTGGTGCTAAAACAACTGAATTTACAGCAGATGCAGGTAAAGACGTTAAAACTTTAAACGTTAAAGATGACGCTTTAGCAACTTTAGACAAAGCTATCAACACCATTGATGAAAGCCGTTCTAAATTAGGTGCGATTCAAAACCGTTTTGAATCTACTATCAACAACCTGAACAACACTGTTAACAACTTATCTGCTTCACGTAGCCGTATCTTAGATGCTGACTATGCAACAGAAGTTTCTAACATGAGCCGTGGTCAAATCTTGCAACAAGCGGGTACTTCAGTACTTGCTCAAGCAAACCAAGTACCACAAACTGTTCTGTCTCTGTTACGTTAATTCGTACCCTGACACAAAAGATACCTTTCTATATCAAAGGCCCTCATCTGAGGGTCTTTTTTGTCATTTTATTTTATATTTAAACTCACTCTGTTTTAGTTTATTTTTTTCTCTCCATCTATTTTTGTTTTTTCTGCTAGTCATTATCTCTTATAAATTAATTAATTGGCTTTTTTTACTATTTTCGCGACGCGAAAACA
设计的引物：5'  GGTTGTATCTGGGGTG  3'     F
                    5'  TCAGATGAGGGCCTTTG  3'   R


引物设计说实在刚接触，不是太懂，来个大佬指导一波，帮我找找问题

根据序列设计完引物，跑完胶测序一对比不完全吻合怎么办
对比图.png
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篮球与科研都很重要~
1楼2018-09-25 21:35:57
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

linhaobua

禁虫 (小有名气)
感谢参与，应助指数 +1
本帖内容被屏蔽
4楼2018-09-26 13:57:34
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xipha

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
渊博震天: 金币+2, 鼓励回帖交流 2018-09-26 17:46:36
不一样的原因有两种，一个是你提取的组织基因就是和NCBI上的不一样，你把你的序列去blast看看。另一个是你的聚合酶和反应体系不对，导致不保真。这个可以在网上搜搜PCR扩增注意事项。
赞一下(1人) 回复此楼
6楼2018-09-26 17:38:05
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zw破风

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你这个引物设计的就不对吧
赞一下(1人) 回复此楼
8楼2018-09-27 11:05:03
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普通回帖

暖心calmyz

银虫 (正式写手)
引物这么短啊

发自小木虫IOS客户端
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2楼2018-09-25 23:33:57
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xydlengyue

金虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 暖心calmyz at 2018-09-25 23:33:57
引物这么短啊

是要长一点吗  大概多长  新手不是太懂
赞一下 回复此楼
篮球与科研都很重要~
3楼2018-09-26 09:57:14
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xydlengyue

金虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by linhaobua at 2018-09-26 13:57:34
引物这个长短也是可以的，方便的话咱们qq联系吧，53084526.有一些细节要沟通，才能解决问题...

好的  谢谢
回复此楼
篮球与科研都很重要~
5楼2018-09-26 14:48:59
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xydlengyue

金虫 (正式写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by xipha at 2018-09-26 17:38:05
不一样的原因有两种，一个是你提取的组织基因就是和NCBI上的不一样，你把你的序列去blast看看。另一个是你的聚合酶和反应体系不对，导致不保真。这个可以在网上搜搜PCR扩增注意事项。

我做的是细菌的  在ncbi上面可以找到该细菌的该序列  应该差别不会这么大的  然后片段只有1100bp  应该不需要太保真吧
赞一下 回复此楼
篮球与科研都很重要~
7楼2018-09-27 10:37:32
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xipha

木虫 (正式写手)
引用回帖:
7楼: Originally posted by xydlengyue at 2018-09-27 10:37:32
我做的是细菌的  在ncbi上面可以找到该细菌的该序列  应该差别不会这么大的  然后片段只有1100bp  应该不需要太保真吧...

如果序列应当一致，扩增体系也没问题，片段又小，你看看会不会扩到细菌基因上的其他同源基因。比如同一家族的不同蛋白，会有一个保守区域，然后其它都差别很大。
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9楼2018-09-27 14:17:45
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xydlengyue

金虫 (正式写手)
引用回帖:
8楼: Originally posted by zw破风 at 2018-09-27 11:05:03
你这个引物设计的就不对吧

怎么说？ 求教
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篮球与科研都很重要~
10楼2018-09-27 16:25:02
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