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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 新药研发 » 工艺研究 » 反相HPLC分离天然多肽
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嘟嘟熊levi

金虫 (小有名气)

[求助] 反相HPLC分离天然多肽 已有3人参与

各位老师，最近实验从天然中药材中分离小分子多肽。
    粉碎药材后，PBS浸泡，离心取上清，3000Da透析袋透析，收集小分子多肽。分子排阻色谱分离，收集洗脱峰，进行HPLC分离鉴定。
    采用梯度洗脱，A：水；B：含有0.1%TFA的乙腈。0 min，A：99%，B：1%；25 min，A：95%，B：5%；32 min；A：85%，B：15%。
    问题是不加TFA没有多肽峰，加了0.1%TFA，基线不稳。整个实验中HPLC的重复性很差。请问各位老师，有什么好方法吗？不胜感激。
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我凝望天涯，寻觅我的诗句
1楼 2018-09-12 14:49:03
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gwmgyp

版主 (知名作家)

搬砖将

优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
波长是不是接近末端的？

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gwmgyp
2楼2018-09-13 00:13:25
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嘟嘟熊levi

金虫 (小有名气)
波长是220nm的。
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我凝望天涯，寻觅我的诗句
3楼2018-09-13 11:23:48
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嘟嘟熊levi

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by gwmgyp at 2018-09-13 00:13:25
波长是不是接近末端的？

就是梯度洗脱为什么基线是飘得。乙腈的用量增多，基线就慢慢上移。这个有没有办法解决啊？谢谢。
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我凝望天涯，寻觅我的诗句
4楼2018-09-13 11:24:50
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天涯不归路

版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你走下空白看看基线还飘不飘，看看飘是你样品引起的还是本身就会飘？
之后你要研究你要分离的多肽的性质，选择的洗脱液是不是合适，是不是可以换成其它，另外可不可以换换凝胶颗粒去分离
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为了明天而努力
5楼2018-09-13 11:54:51
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嘟嘟熊levi

金虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 天涯不归路 at 2018-09-13 11:54:51
你走下空白看看基线还飘不飘，看看飘是你样品引起的还是本身就会飘？
之后你要研究你要分离的多肽的性质，选择的洗脱液是不是合适，是不是可以换成其它，另外可不可以换换凝胶颗粒去分离

在220nm下，检测基线就是逐渐上移的。在280nm下，基线就平稳。只是多肽要求是220nm检测，用酶标仪测试也是，220nm的峰很多，280nm要少一些。
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我凝望天涯，寻觅我的诗句
6楼2018-09-13 14:35:56
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天涯不归路

版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

引用回帖:
6楼: Originally posted by 嘟嘟熊levi at 2018-09-13 14:35:56
在220nm下，检测基线就是逐渐上移的。在280nm下，基线就平稳。只是多肽要求是220nm检测，用酶标仪测试也是，220nm的峰很多，280nm要少一些。...

280可能有一些峰被掩盖了吧！还是用峰多的那个，看看能不能调整下洗脱速率和梯度，把峰拉开！选择你要的那个峰值去接收！
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为了明天而努力
7楼2018-09-13 21:03:48
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王勃

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
先扫一个全波长，看看样品的最大吸光值，再有建议流动相A液也加上0.1%TFA
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我相信我自己
8楼2018-09-14 10:21:51
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嘟嘟熊levi

金虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by 王勃 at 2018-09-14 10:21:51
先扫一个全波长，看看样品的最大吸光值，再有建议流动相A液也加上0.1%TFA

谢谢指点。全波段扫描，主峰在210nm左右，260nm有一个小的吸收峰。更多的论文中说多肽检测是220nm。
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我凝望天涯，寻觅我的诗句
9楼2018-09-14 11:13:06
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嘟嘟熊levi

金虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by 王勃 at 2018-09-14 10:21:51
先扫一个全波长，看看样品的最大吸光值，再有建议流动相A液也加上0.1%TFA

谢谢指点。全波段扫描，主峰在210nm左右，260nm有一个小的吸收峰。更多的论文中说多肽检测是220nm。
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我凝望天涯，寻觅我的诗句
10楼2018-09-14 11:14:32
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