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嘟嘟熊levi

金虫 (小有名气)

[求助] 反相HPLC分离天然多肽已有3人参与

各位老师,最近实验从天然中药材中分离小分子多肽。
    粉碎药材后,PBS浸泡,离心取上清,3000Da透析袋透析,收集小分子多肽。分子排阻色谱分离,收集洗脱峰,进行HPLC分离鉴定。
    采用梯度洗脱,A:水;B:含有0.1%TFA的乙腈。0 min,A:99%,B:1%;25 min,A:95%,B:5%;32 min;A:85%,B:15%。
    问题是不加TFA没有多肽峰,加了0.1%TFA,基线不稳。整个实验中HPLC的重复性很差。请问各位老师,有什么好方法吗?不胜感激。
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我凝望天涯,寻觅我的诗句
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嘟嘟熊levi

金虫 (小有名气)

波长是220nm的。
我凝望天涯,寻觅我的诗句
3楼2018-09-13 11:23:48
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嘟嘟熊levi

金虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by gwmgyp at 2018-09-13 00:13:25
波长是不是接近末端的?

就是梯度洗脱为什么基线是飘得。乙腈的用量增多,基线就慢慢上移。这个有没有办法解决啊?谢谢。
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4楼2018-09-13 11:24:50
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嘟嘟熊levi

金虫 (小有名气)

引用回帖:
5楼: Originally posted by 天涯不归路 at 2018-09-13 11:54:51
你走下空白看看基线还飘不飘,看看飘是你样品引起的还是本身就会飘?
之后你要研究你要分离的多肽的性质,选择的洗脱液是不是合适,是不是可以换成其它,另外可不可以换换凝胶颗粒去分离

在220nm下,检测基线就是逐渐上移的。在280nm下,基线就平稳。只是多肽要求是220nm检测,用酶标仪测试也是,220nm的峰很多,280nm要少一些。
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6楼2018-09-13 14:35:56
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嘟嘟熊levi

金虫 (小有名气)

引用回帖:
8楼: Originally posted by 王勃 at 2018-09-14 10:21:51
先扫一个全波长,看看样品的最大吸光值,再有建议流动相A液也加上0.1%TFA

谢谢指点。全波段扫描,主峰在210nm左右,260nm有一个小的吸收峰。更多的论文中说多肽检测是220nm。
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9楼2018-09-14 11:13:06
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嘟嘟熊levi

金虫 (小有名气)

引用回帖:
8楼: Originally posted by 王勃 at 2018-09-14 10:21:51
先扫一个全波长,看看样品的最大吸光值,再有建议流动相A液也加上0.1%TFA

谢谢指点。全波段扫描,主峰在210nm左右,260nm有一个小的吸收峰。更多的论文中说多肽检测是220nm。
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10楼2018-09-14 11:14:32
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嘟嘟熊levi

金虫 (小有名气)

引用回帖:
7楼: Originally posted by 天涯不归路 at 2018-09-13 21:03:48
280可能有一些峰被掩盖了吧!还是用峰多的那个,看看能不能调整下洗脱速率和梯度,把峰拉开!选择你要的那个峰值去接收!...

谢谢。图片我还不会上传。我的洗脱是从1min-32min,乙腈从1%上升到30%。出峰5min开始,前15min比较集中。想请问一下,把峰拉开可以怎么操作。
我凝望天涯,寻觅我的诗句
11楼2018-09-14 11:16:43
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嘟嘟熊levi

金虫 (小有名气)

引用回帖:
12楼: Originally posted by 天涯不归路 at 2018-09-14 11:44:44
一般可以调整有机相比例,已经洗脱速率!或者更换洗脱机之类...

还想请问一下,假如多肽的极性不强,那我调高流动相的极性,峰是不是该出来的更快啊?
我凝望天涯,寻觅我的诗句
13楼2018-09-14 16:21:35
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