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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 大家是怎么做细菌蛋白表达的？？
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胡笳桃子

新虫 (小有名气)

[交流] 大家是怎么做细菌蛋白表达的？？

挑取转化平板上的转化子，经质粒提取验证后，是取其中一个转化子进行表达研究呢？还是平行取若干个转化子？

也就是说，同样是某个基因转化BL21（DE3），得到的转化子之间，其表达会不会有很大的不同？会不会存在有些转化子没能表达蛋白、甚至没有活力，而有些却可以？

之前挑取了一个转化子在研究，SDS-PAGE无法检测到目的蛋白，所以才想到这个问题。麻烦解答！！！！！

谢谢！！！！！
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赠人玫瑰，手有余香。
1楼 2009-04-02 22:28:47
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yidiankucao

铁虫 (初入文坛)
★
sutao1979(金币+1,VIP+0):thank you 4-3 17:00
一个板上的斑尽量多挑几个，呈十字形散开挑，有可能挑的会是假阳性。所以他们个体还是有差异的。尽量挑那些特别孤立的，不跟其它点相连的。这样的成功率会很高的。
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2楼2009-04-03 01:13:22
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wjswj

木虫 (正式写手)

小木虫领金币专业户
★
sutao1979(金币+1,VIP+0):thank you 4-3 17:01
理论上讲应该都一样，但是实际上还是可能存在个体差异，所以还是挑几个平行的一起做。转化子不表达也有可能不是你转化的问题，很有可能是外源片段就有问题，所以一般都应先测序以确定编码框，序列的正确性，然后再摸索表达条件，表达时间等等，SDS-PAGE看不到也并不能说明一切，还有可能是表达完了又被降解等原因。
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金币是赌出来的
3楼2009-04-03 09:06:00
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spiderboy

金虫 (正式写手)
★
sutao1979(金币+1,VIP+0):thank you 4-3 17:01
同意楼上的。。做生物存在几率问题，所以平行实验是必须要做的，也是我们所需要的思维习惯。。楼主所说的情况当时是肯定会发生的了，因为会存在转化不进去的，也会存在转化进去但是是假阳性的（目的基因没有重组到你的载体里）。。所以要做平行的实验，多鉴定。
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4楼2009-04-03 09:07:23
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蓝色基因

金虫 (正式写手)
★
350784478(金币+1):xiexie
挑取10个左右转化平板上的转化子，经质粒提取验证后，先单酶切再双酶切，挑选其中正确的条带测序。

然后用测序正确克隆做蛋白表达。
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5楼2009-04-03 10:01:08
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anik

银虫 (正式写手)
★
350784478(金币+1):xiexie
在做到表达的时候需要同时挑选几个用以平行试验，直到你已经确定了其中的一个有表达了，就研究这一个。送测序及打质谱都是挺贵的，不可能同一个基因做多个，所以前面的要多做些
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6楼2009-04-03 17:12:59
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小驹8578

新虫 (初入文坛)
★
350784478(金币+1):xiexie
理论上讲不会出现有的转化子有活性，而有的没有活性的情况。但做得时候可以多挑两个平行做，如果都没有蛋白表达，你可以看看基因连入载体是否正确，阅读框是否正确，建议测序看看是否有突变（有时有突变可能造成蛋白截短表达，表达出比预计目的蛋白小的蛋白）。另外，你检测的是全蛋白还是全蛋白离心后的上清液？有时蛋白会不可溶表达，所以不会出现在蛋白离心后的上清液里面。
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7楼2009-04-03 17:27:10
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胡笳桃子

新虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by anik at 2009-4-3 17:12:
在做到表达的时候需要同时挑选几个用以平行试验，直到你已经确定了其中的一个有表达了，就研究这一个。送测序及打质谱都是挺贵的，不可能同一个基因做多个，所以前面的要多做些

我检测的是细菌离心后的上清，以及冻融破壁之后的离心上清。不晓得包不包含您所说的不溶性蛋白。请指教！！！！！！
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赠人玫瑰，手有余香。
8楼2009-04-05 20:23:35
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胡笳桃子

新虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by wjswj at 2009-4-3 09:06:
理论上讲应该都一样，但是实际上还是可能存在个体差异，所以还是挑几个平行的一起做。转化子不表达也有可能不是你转化的问题，很有可能是外源片段就有问题，所以一般都应先测序以确定编码框，序列的正确性，然后再 ...

表达完了被降解啊？这个问题我没有考虑到。。。。。要怎么避免呢？
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赠人玫瑰，手有余香。
9楼2009-04-05 20:24:10
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胡笳桃子

新虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by spiderboy at 2009-4-3 09:07:
同意楼上的。。做生物存在几率问题，所以平行实验是必须要做的，也是我们所需要的思维习惯。。楼主所说的情况当时是肯定会发生的了，因为会存在转化不进去的，也会存在转化进去但是是假阳性的（目的基因没有重组到 ...

可是我提质粒验证了啊，怎么会是假阳性呢？
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赠人玫瑰，手有余香。
10楼2009-04-05 20:25:00
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