应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 大家是怎么做细菌蛋白表达的？？
161/2返回列表12下一页
查看: 876  |  回复: 15
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
当前主题已经存档。

胡笳桃子

新虫 (小有名气)

[交流] 大家是怎么做细菌蛋白表达的？？

挑取转化平板上的转化子，经质粒提取验证后，是取其中一个转化子进行表达研究呢？还是平行取若干个转化子？

也就是说，同样是某个基因转化BL21（DE3），得到的转化子之间，其表达会不会有很大的不同？会不会存在有些转化子没能表达蛋白、甚至没有活力，而有些却可以？

之前挑取了一个转化子在研究，SDS-PAGE无法检测到目的蛋白，所以才想到这个问题。麻烦解答！！！！！

谢谢！！！！！
回复此楼

» 猜你喜欢
赠人玫瑰，手有余香。
1楼 2009-04-02 22:28:47
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

yidiankucao

铁虫 (初入文坛)
★
sutao1979(金币+1,VIP+0):thank you 4-3 17:00
一个板上的斑尽量多挑几个，呈十字形散开挑，有可能挑的会是假阳性。所以他们个体还是有差异的。尽量挑那些特别孤立的，不跟其它点相连的。这样的成功率会很高的。
赞一下(6人) 回复此楼
2楼2009-04-03 01:13:22
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

wjswj

木虫 (正式写手)

小木虫领金币专业户
★
sutao1979(金币+1,VIP+0):thank you 4-3 17:01
理论上讲应该都一样，但是实际上还是可能存在个体差异，所以还是挑几个平行的一起做。转化子不表达也有可能不是你转化的问题，很有可能是外源片段就有问题，所以一般都应先测序以确定编码框，序列的正确性，然后再摸索表达条件，表达时间等等，SDS-PAGE看不到也并不能说明一切，还有可能是表达完了又被降解等原因。
赞一下(6人) 回复此楼
金币是赌出来的
3楼2009-04-03 09:06:00
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

spiderboy

金虫 (正式写手)
★
sutao1979(金币+1,VIP+0):thank you 4-3 17:01
同意楼上的。。做生物存在几率问题，所以平行实验是必须要做的，也是我们所需要的思维习惯。。楼主所说的情况当时是肯定会发生的了，因为会存在转化不进去的，也会存在转化进去但是是假阳性的（目的基因没有重组到你的载体里）。。所以要做平行的实验，多鉴定。
赞一下(6人) 回复此楼
4楼2009-04-03 09:07:23
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

蓝色基因

金虫 (正式写手)
★
350784478(金币+1):xiexie
挑取10个左右转化平板上的转化子，经质粒提取验证后，先单酶切再双酶切，挑选其中正确的条带测序。

然后用测序正确克隆做蛋白表达。
赞一下(1人) 回复此楼
5楼2009-04-03 10:01:08
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

anik

银虫 (正式写手)
★
350784478(金币+1):xiexie
在做到表达的时候需要同时挑选几个用以平行试验，直到你已经确定了其中的一个有表达了，就研究这一个。送测序及打质谱都是挺贵的，不可能同一个基因做多个，所以前面的要多做些
赞一下(1人) 回复此楼
6楼2009-04-03 17:12:59
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

小驹8578

新虫 (初入文坛)
★
350784478(金币+1):xiexie
理论上讲不会出现有的转化子有活性，而有的没有活性的情况。但做得时候可以多挑两个平行做，如果都没有蛋白表达，你可以看看基因连入载体是否正确，阅读框是否正确，建议测序看看是否有突变（有时有突变可能造成蛋白截短表达，表达出比预计目的蛋白小的蛋白）。另外，你检测的是全蛋白还是全蛋白离心后的上清液？有时蛋白会不可溶表达，所以不会出现在蛋白离心后的上清液里面。
赞一下(1人) 回复此楼
7楼2009-04-03 17:27:10
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

胡笳桃子

新虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by anik at 2009-4-3 17:12:
在做到表达的时候需要同时挑选几个用以平行试验，直到你已经确定了其中的一个有表达了，就研究这一个。送测序及打质谱都是挺贵的，不可能同一个基因做多个，所以前面的要多做些

我检测的是细菌离心后的上清，以及冻融破壁之后的离心上清。不晓得包不包含您所说的不溶性蛋白。请指教！！！！！！
赞一下 回复此楼
赠人玫瑰，手有余香。
8楼2009-04-05 20:23:35
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

胡笳桃子

新虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by wjswj at 2009-4-3 09:06:
理论上讲应该都一样，但是实际上还是可能存在个体差异，所以还是挑几个平行的一起做。转化子不表达也有可能不是你转化的问题，很有可能是外源片段就有问题，所以一般都应先测序以确定编码框，序列的正确性，然后再 ...

表达完了被降解啊？这个问题我没有考虑到。。。。。要怎么避免呢？
赞一下 回复此楼
赠人玫瑰，手有余香。
9楼2009-04-05 20:24:10
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

胡笳桃子

新虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by spiderboy at 2009-4-3 09:07:
同意楼上的。。做生物存在几率问题，所以平行实验是必须要做的，也是我们所需要的思维习惯。。楼主所说的情况当时是肯定会发生的了，因为会存在转化不进去的，也会存在转化进去但是是假阳性的（目的基因没有重组到 ...

可是我提质粒验证了啊，怎么会是假阳性呢？
赞一下 回复此楼
赠人玫瑰，手有余香。
10楼2009-04-05 20:25:00
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 胡笳桃子 的主题更新
161/2返回列表12下一页
普通表情 龙 兔 虎 猫 高级回复 (可上传附件)
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 材料化工调剂 +10 今夏不夏 2026-03-01 11/550 2026-03-01 19:49 by 无懈可击111
[考研] 化工299分求调剂 一志愿985落榜 +5 嘻嘻(*^ω^*) 2026-03-01 5/250 2026-03-01 19:47 by 无际的草原
[考研] 材料学硕318求调剂 +9 February_Feb 2026-03-01 11/550 2026-03-01 19:47 by 无懈可击111
[考研] 0856材料求调剂 +11 hyf hyf hyf 2026-02-28 12/600 2026-03-01 18:57 by 18137688336
[考研] 291分工科求调剂 +9 science饿饿 2026-03-01 10/500 2026-03-01 18:55 by 18137688336
[考研] 321求调剂一志愿东北林业大学材料与化工英二数二 +4 虫虫虫虫虫7 2026-03-01 7/350 2026-03-01 16:52 by caszguilin
[考研] 0856材料求调剂 +4 麻辣鱿鱼 2026-02-28 4/200 2026-03-01 16:51 by caszguilin
[考研] 化工专硕342，一志愿大连理工大学，求调剂 +3 kyf化工 2026-02-28 4/200 2026-03-01 16:49 by yywzz
[基金申请] 刚录用，没有期刊号，但是在线可看的论文可以放为代表作吗 10+3 arang1 2026-03-01 3/150 2026-03-01 16:43 by babero
[考研] 313求调剂 +3 水流年lc 2026-02-28 3/150 2026-03-01 16:01 by 新能源达人
[考研] 307求调剂 +5 wyyyqx 2026-03-01 5/250 2026-03-01 15:21 by Fff-1
[考研] 303求调剂 +4 今夏不夏 2026-03-01 4/200 2026-03-01 14:46 by 嘟嘟小浣熊
[考研] 课题组接收材料类调剂研究生 +3 gaoxiaoniuma 2026-02-28 4/200 2026-03-01 14:30 by jjj三跨
[考研] 302材料工程求调剂 +4 Doleres 2026-03-01 5/250 2026-03-01 11:52 by liqiongjy
[考研] 317一志愿华南理工电气工程求调剂 +6 Soliloquy_Q 2026-02-28 11/550 2026-03-01 11:14 by 歌liekkas
[硕博家园] 博士自荐 +6 科研狗111 2026-02-26 10/500 2026-03-01 10:02 by 科研狗111
[考研] 材料调剂 +4 爱擦汗的可乐冰 2026-02-28 4/200 2026-03-01 00:38 by 猫猫球alter
[考研] 307求调剂 +4 73372112 2026-02-28 6/300 2026-03-01 00:04 by ll247
[考研] 085600材料工程一志愿中科大总分312求调剂 +8 吃宵夜1 2026-02-28 10/500 2026-02-28 20:27 by L135790
[高分子] 求环氧树脂研发1名 +3 孙xc 2026-02-25 11/550 2026-02-28 16:57 by ichall
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭