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胡笳桃子

新虫 (小有名气)

[交流] 大家是怎么做细菌蛋白表达的??

挑取转化平板上的转化子,经质粒提取验证后,是取其中一个转化子进行表达研究呢?还是平行取若干个转化子?

也就是说,同样是某个基因转化BL21(DE3),得到的转化子之间,其表达会不会有很大的不同?会不会存在有些转化子没能表达蛋白、甚至没有活力,而有些却可以?

之前挑取了一个转化子在研究,SDS-PAGE无法检测到目的蛋白,所以才想到这个问题。麻烦解答!!!!!

谢谢!!!!!
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赠人玫瑰,手有余香。
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spiderboy

金虫 (正式写手)


sutao1979(金币+1,VIP+0):thank you 4-3 17:01
同意楼上的。。做生物存在几率问题,所以平行实验是必须要做的,也是我们所需要的思维习惯。。楼主所说的情况当时是肯定会发生的了,因为会存在转化不进去的,也会存在转化进去但是是假阳性的(目的基因没有重组到你的载体里)。。所以要做平行的实验,多鉴定。
4楼2009-04-03 09:07:23
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yidiankucao

铁虫 (初入文坛)


sutao1979(金币+1,VIP+0):thank you 4-3 17:00
一个板上的斑尽量多挑几个,呈十字形散开挑,有可能挑的会是假阳性。所以他们个体还是有差异的。尽量挑那些特别孤立的,不跟其它点相连的。这样的成功率会很高的。
2楼2009-04-03 01:13:22
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wjswj

木虫 (正式写手)

小木虫领金币专业户


sutao1979(金币+1,VIP+0):thank you 4-3 17:01
理论上讲应该都一样,但是实际上还是可能存在个体差异,所以还是挑几个平行的一起做。转化子不表达也有可能不是你转化的问题,很有可能是外源片段就有问题,所以一般都应先测序以确定编码框,序列的正确性,然后再摸索表达条件,表达时间等等,SDS-PAGE看不到也并不能说明一切,还有可能是表达完了又被降解等原因。
金币是赌出来的
3楼2009-04-03 09:06:00
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蓝色基因

金虫 (正式写手)


350784478(金币+1):xiexie
挑取10个左右转化平板上的转化子,经质粒提取验证后,先单酶切再双酶切,挑选其中正确的条带测序。

然后用测序正确克隆做蛋白表达。
5楼2009-04-03 10:01:08
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