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青柠檬PCR

新虫 (正式写手)

[求助] pcr 已有1人参与

想问下有没有人在设计引物时，以环装质粒为模板6300bp，几乎要扩增下来整个片段，然后引物r为61bp，gc含量62.3%，Tm99.8，f为41bp，gc含量53.7%，Tm86，然后用了高保真和pcr enhancer，结果有个1300左右的条带，
想问下是什么问题

@biostar2009 @飞约疯人院 @wizardfan @youlinglyw 发自小木虫Android客户端
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1楼 2018-07-27 23:34:54
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ghst110

银虫 (正式写手)
为什么要搞这么长的引物？都是特异匹配的吗？以环状质粒做定点突变，也是要扩增下整个质粒。并不难。你再摸索一下条件吧，1300说明引物退火到非目的序列了

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*才随遇长，识以穷精*
2楼2018-07-27 23:55:29
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青柠檬PCR

新虫 (正式写手)
因为想用一步克隆法，还想加个his，所以有点长，这种情况，是退火温度是低还是高啊，

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3楼2018-07-28 00:00:35
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青柠檬PCR

新虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by ghst110 at 2018-07-27 23:55:29
为什么要搞这么长的引物？都是特异匹配的吗？以环状质粒做定点突变，也是要扩增下整个质粒。并不难。你再摸索一下条件吧，1300说明引物退火到非目的序列了

因为想用一步克隆法，还想加个his，所以有点长，这种情况，是退火温度是低还是高啊

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4楼2018-07-28 00:01:13
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ghst110

银虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 青柠檬PCR at 2018-07-28 00:01:13
因为想用一步克隆法，还想加个his，所以有点长，这种情况，是退火温度是低还是高啊
...

明白了，你加的6his或者其他酶切位点或保护碱基都不要算，Tm要以严格与模板碱基互补配对的靠近3'端计算，一般这段序列不超过30bp就够了。我猜你程序退火高了。以质粒做模板相比基因组是非常好扩增的实验，注意不要加太多质粒模板吧

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5楼2018-07-28 00:07:32
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每天进步点

禁虫 (初入文坛)
本帖内容被屏蔽
6楼2018-07-28 00:08:09
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青柠檬PCR

新虫 (正式写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by ghst110 at 2018-07-28 00:07:32
明白了，你加的6his或者其他酶切位点或保护碱基都不要算，Tm要以严格与模板碱基互补配对的靠近3'端计算，一般这段序列不超过30bp就够了。我猜你程序退火高了。以质粒做模板相比基因组是非常好扩增的实验，注意不要 ...

退货温度55度，那个一步同源要和同源壁重合20左右，特异引物也要20bp，再加酶切位点什么的，18bphis够长，这个退火温度要改吗，看有人加DMSO

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7楼2018-07-28 00:13:43
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青柠檬PCR

新虫 (正式写手)
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6楼: Originally posted by 每天进步点 at 2018-07-28 00:08:09
退火温度好高啊

有什么好方法吗，引物合成也只能这样了

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8楼2018-07-28 00:14:27
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ghst110

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
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7楼: Originally posted by 青柠檬PCR at 2018-07-28 00:13:43
退货温度55度，那个一步同源要和同源壁重合20左右，特异引物也要20bp，再加酶切位点什么的，18bphis够长，这个退火温度要改吗，看有人加DMSO
...

当然要改啊，只算3端匹配的。你要不想计算直接无脑65℃touchdown 10个循环，然后55退火好了，除非引物太糟糕，这个基本会work的

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*才随遇长，识以穷精*
9楼2018-07-28 00:20:08
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ghst110

银虫 (正式写手)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 青柠檬PCR at 2018-07-28 00:13:43
退货温度55度，那个一步同源要和同源壁重合20左右，特异引物也要20bp，再加酶切位点什么的，18bphis够长，这个退火温度要改吗，看有人加DMSO
...

超过65%才算高gc，你的情况可加可不加，那就不加了，dmso略微影响Tm和保真度。

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*才随遇长，识以穷精*
10楼2018-07-28 00:22:25
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