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青柠檬PCR新虫 (正式写手)
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想问下有没有人在设计引物时，以环装质粒为模板6300bp，几乎要扩增下来整个片段，然后引物r为61bp，gc含量62.3%，Tm99.8，f为41bp，gc含量53.7%，Tm86，然后用了高保真和pcr enhancer，结果有个1300左右的条带， 想问下是什么问题 @biostar2009 @飞约疯人院 @wizardfan @youlinglyw 发自小木虫Android客户端 |
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2楼2018-07-27 23:55:29
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3楼2018-07-28 00:00:35
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4楼2018-07-28 00:01:13
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明白了，你加的6his或者其他酶切位点或保护碱基都不要算，Tm要以严格与模板碱基互补配对的靠近3'端计算，一般这段序列不超过30bp就够了。我猜你程序退火高了。以质粒做模板相比基因组是非常好扩增的实验，注意不要加太多质粒模板吧 发自小木虫Android客户端 |
5楼2018-07-28 00:07:32
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6楼2018-07-28 00:08:09
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退货温度55度，那个一步同源要和同源壁重合20左右，特异引物也要20bp，再加酶切位点什么的，18bphis够长，这个退火温度要改吗，看有人加DMSO 发自小木虫Android客户端 |
7楼2018-07-28 00:13:43
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8楼2018-07-28 00:14:27
【答案】应助回帖
感谢参与，应助指数 +1
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当然要改啊，只算3端匹配的。你要不想计算直接无脑65℃touchdown 10个循环，然后55退火好了，除非引物太糟糕，这个基本会work的 发自小木虫Android客户端 |
9楼2018-07-28 00:20:08
10楼2018-07-28 00:22:25