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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 发酵/表达 » 毕赤酵母表达蛋白求助
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三鱼舟

新虫 (初入文坛)

[求助] 毕赤酵母表达蛋白求助 已有4人参与

我的蛋白在毕赤酵母GS115 mut+ 中表达，大小在37kda左右，利用BMMY进行蛋白诱导，甲醇浓度为0.5%，诱导48h 72h后进行检测，发现上清中没有我要的蛋白，但是在沉淀中出现了45kda左右的条带,这是western blot的结果。做了阴性对照，我自己觉得沉淀中的蛋白可能是因为α肽没有被切掉，蛋白被滞留在了内质网没有分泌出来。
请问各位有没有出现过这种情况，如果有的话该怎么解决！跪谢！！

@天使托 发自小木虫Android客户端
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1楼 2018-06-29 16:55:45
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渊博震天

版主 (职业作家)

Yeast Display

优秀版主优秀版主
请问上清液检测蛋白是用SDS-PAGE的吗？用不用浓缩？酶活啥时候测？

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2楼2018-07-03 14:50:29
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三鱼舟

新虫 (初入文坛)
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2楼: Originally posted by 渊博震天 at 2018-07-03 14:50:29
请问上清液检测蛋白是用SDS-PAGE的吗？用不用浓缩？酶活啥时候测？

是的，SDS-PAGE和WB都检测了，都没有，酶活没检测

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3楼2018-07-03 17:33:47
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三鱼舟

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 渊博震天 at 2018-07-03 14:50:29
请问上清液检测蛋白是用SDS-PAGE的吗？用不用浓缩？酶活啥时候测？

浓缩了，而且浓缩近百倍

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4楼2018-07-03 17:34:31
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渊博震天

版主 (职业作家)

Yeast Display

优秀版主优秀版主
引用回帖:
3楼: Originally posted by 三鱼舟 at 2018-07-03 17:33:47
是的，SDS-PAGE和WB都检测了，都没有，酶活没检测
...

好的，谢谢
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5楼2018-07-03 17:59:25
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-字仲康

禁虫 (正式写手)
本帖内容被屏蔽
6楼2018-07-03 19:23:40
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三鱼舟

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by -字仲康 at 2018-07-03 19:23:40
a信号肽被切割了，不才是滞留在胞内吗？
45KD处似乎会是有宿主蛋白的。没有的话，可能是蛋白没有表达吧

阴性对照胞内没有这条带，说明不是宿主的蛋白。

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7楼2018-07-05 14:42:49
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凯恩血蹄

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

没做过这种，但做过相关的，诱导后甲醇浓度不应一直为0.5%，甲醇浓度高会导致酵母菌中毒，繁殖慢，所需甲醇的补加量应该随酵母菌数量变化，所以需要建立甲醇补料的数学模型（建好模型就不需要购买培养基诱导了）。培养48、72小时，时间太短，连续发酵10-15天试试
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三鱼舟
8楼2018-07-08 12:24:14
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三鱼舟

新虫 (初入文坛)
送红花一朵
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8楼: Originally posted by 凯恩血蹄 at 2018-07-08 12:24:14
没做过这种，但做过相关的，诱导后甲醇浓度不应一直为0.5%，甲醇浓度高会导致酵母菌中毒，繁殖慢，所需甲醇的补加量应该随酵母菌数量变化，所以需要建立甲醇补料的数学模型（建好模型就不需要购买培养基诱导了）。培 ...

您好，我想问一下，您有了解怎么样去建立甲醇添加的数学模型？还有为什么要诱导时间这么长？10多天不是会有蛋白降解，菌死亡等问题吗？

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9楼2018-07-08 14:25:08
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凯恩血蹄

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
9楼: Originally posted by 三鱼舟 at 2018-07-08 14:25:08
您好，我想问一下，您有了解怎么样去建立甲醇添加的数学模型？还有为什么要诱导时间这么长？10多天不是会有蛋白降解，菌死亡等问题吗？
...

这方面的资料很多，网上、书上都有，但需要根据自己的情况找出那几个常数。我说的10-15天是诱导后培养时间，完成甲醇诱导后持续培养的时间。甲醇诱导阶段一般不会超过24h。
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10楼2018-07-09 18:46:47
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