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meng199102

新虫 (小有名气)

[求助] 10几个碱基杂交能不能用PAGE电泳跑出来? 已有2人参与

最近跑胶跑到怀疑人生了。现求助万能的虫友,我的实验如下:
两条单链分别是30和60个碱基,但是只有连续12个碱基是互补的,我想通过电泳证明他们确实杂交了。目前试过10-20%的非变性PAGE胶和琼脂糖胶了,退火后室温静置2-3小时,loading dye 都跑出来,也没有显示出杂交带。有没有小伙伴有相关经验求告知,求分享啊!
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petty04

新虫 (职业作家)

★ ★
渊博震天: 金币+2, 鼓励积极回帖交流 2018-06-27 08:39:39
4℃跑胶,低电压长时间跑,胶里要加Mg离子,应该可以跑出杂交条带

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» 本帖已获得的红花(最新10朵)

2楼2018-06-27 08:33:22
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张青峰

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
meng199102: 金币+15, 有帮助 2018-06-27 23:19:57
感觉有难度,12个碱基Tm值是多少?两条链有没有二级结构?如果两条单链自身形成的二级结构Tm较高,很难形成双链。
也只能试试了,像二楼说的加Mg2+。

» 本帖已获得的红花(最新10朵)

3楼2018-06-27 10:24:27
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meng199102

新虫 (小有名气)

送红花一朵
引用回帖:
2楼: Originally posted by petty04 at 2018-06-27 08:33:22
4℃跑胶,低电压长时间跑,胶里要加Mg离子,应该可以跑出杂交条带

谢谢你的建议!有试过100 v跑2小时, 没试过低温跑。试过杂交的时候加Mg,请问胶里加Mg是防止跑胶的时候解链吗?
4楼2018-06-27 23:06:18
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meng199102

新虫 (小有名气)

送红花一朵
引用回帖:
3楼: Originally posted by 张青峰 at 2018-06-27 10:24:27
感觉有难度,12个碱基Tm值是多少?两条链有没有二级结构?如果两条单链自身形成的二级结构Tm较高,很难形成双链。
也只能试试了,像二楼说的加Mg2+。

非常感谢!还真没想过Tm的问题,其中有一条链有二级结构。只能先试试低温加Mg跑了。之前还有看到文献说用变性PAGE胶跑的,到时候都试试。
5楼2018-06-27 23:19:36
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meng199102

新虫 (小有名气)

送红花一朵
引用回帖:
2楼: Originally posted by petty04 at 2018-06-27 08:33:22
4℃跑胶,低电压长时间跑,胶里要加Mg离子,应该可以跑出杂交条带

按你说的试了,果然能跑开。再次感谢
6楼2018-06-29 03:20:45
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lapt

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
meng199102: 金币+10, ★★★很有帮助 2018-07-04 02:11:08
镁离子可以稳定双链的形成,建议跑胶条件与反应条件保持一致,推荐用5mM镁离子以上,都可以试试
7楼2018-07-03 16:19:28
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meng199102

新虫 (小有名气)

引用回帖:
7楼: Originally posted by lapt at 2018-07-03 16:19:28
镁离子可以稳定双链的形成,建议跑胶条件与反应条件保持一致,推荐用5mM镁离子以上,都可以试试

谢谢!不过我一直试到20 mM 镁离子才有效果,我看别人基本10mM就能行,不知道是不是有什么其他问题
8楼2018-07-04 02:12:30
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lapt

木虫 (正式写手)

你可以使用IDT网站计算双链杂交的反应焓变,模拟杂交,看是不是反应本身的问题。

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9楼2018-07-05 09:31:46
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雨后春笋!

银虫 (正式写手)

引用回帖:
9楼: Originally posted by lapt at 2018-07-05 09:31:46
你可以使用IDT网站计算双链杂交的反应焓变,模拟杂交,看是不是反应本身的问题。

你好,我想问一下那个IDT网站怎么用的,我不知道怎么计算两条杂交链的反应焓变,求指教

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10楼2018-09-14 11:56:05
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