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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 核酸杂交 » 10几个碱基杂交能不能用PAGE电泳跑出来？
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meng199102

新虫 (小有名气)

[求助] 10几个碱基杂交能不能用PAGE电泳跑出来？ 已有2人参与

最近跑胶跑到怀疑人生了。现求助万能的虫友，我的实验如下：
两条单链分别是30和60个碱基，但是只有连续12个碱基是互补的，我想通过电泳证明他们确实杂交了。目前试过10-20%的非变性PAGE胶和琼脂糖胶了，退火后室温静置2-3小时，loading dye 都跑出来，也没有显示出杂交带。有没有小伙伴有相关经验求告知，求分享啊！
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1楼 2018-06-27 08:15:39
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petty04

新虫 (职业作家)
★ ★
渊博震天: 金币+2, 鼓励积极回帖交流 2018-06-27 08:39:39
4℃跑胶，低电压长时间跑，胶里要加Mg离子，应该可以跑出杂交条带

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meng199102 meng199102
2楼2018-06-27 08:33:22
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张青峰

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
meng199102: 金币+15, ★有帮助 2018-06-27 23:19:57
感觉有难度，12个碱基Tm值是多少？两条链有没有二级结构？如果两条单链自身形成的二级结构Tm较高，很难形成双链。
也只能试试了，像二楼说的加Mg2+。
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meng199102
3楼2018-06-27 10:24:27
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meng199102

新虫 (小有名气)
送红花一朵
引用回帖:
2楼: Originally posted by petty04 at 2018-06-27 08:33:22
4℃跑胶，低电压长时间跑，胶里要加Mg离子，应该可以跑出杂交条带

谢谢你的建议！有试过100 v跑2小时， 没试过低温跑。试过杂交的时候加Mg，请问胶里加Mg是防止跑胶的时候解链吗?
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4楼2018-06-27 23:06:18
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meng199102

新虫 (小有名气)
送红花一朵
引用回帖:
3楼: Originally posted by 张青峰 at 2018-06-27 10:24:27
感觉有难度，12个碱基Tm值是多少？两条链有没有二级结构？如果两条单链自身形成的二级结构Tm较高，很难形成双链。
也只能试试了，像二楼说的加Mg2+。

非常感谢！还真没想过Tm的问题，其中有一条链有二级结构。只能先试试低温加Mg跑了。之前还有看到文献说用变性PAGE胶跑的，到时候都试试。
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5楼2018-06-27 23:19:36
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meng199102

新虫 (小有名气)
送红花一朵
引用回帖:
2楼: Originally posted by petty04 at 2018-06-27 08:33:22
4℃跑胶，低电压长时间跑，胶里要加Mg离子，应该可以跑出杂交条带

按你说的试了，果然能跑开。再次感谢
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6楼2018-06-29 03:20:45
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lapt

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
meng199102: 金币+10, ★★★很有帮助 2018-07-04 02:11:08
镁离子可以稳定双链的形成，建议跑胶条件与反应条件保持一致，推荐用5mM镁离子以上，都可以试试
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7楼2018-07-03 16:19:28
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meng199102

新虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by lapt at 2018-07-03 16:19:28
镁离子可以稳定双链的形成，建议跑胶条件与反应条件保持一致，推荐用5mM镁离子以上，都可以试试

谢谢！不过我一直试到20 mM 镁离子才有效果，我看别人基本10mM就能行，不知道是不是有什么其他问题
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8楼2018-07-04 02:12:30
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lapt

木虫 (正式写手)
你可以使用IDT网站计算双链杂交的反应焓变，模拟杂交，看是不是反应本身的问题。

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9楼2018-07-05 09:31:46
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雨后春笋！

银虫 (正式写手)
引用回帖:
9楼: Originally posted by lapt at 2018-07-05 09:31:46
你可以使用IDT网站计算双链杂交的反应焓变，模拟杂交，看是不是反应本身的问题。

你好，我想问一下那个IDT网站怎么用的，我不知道怎么计算两条杂交链的反应焓变，求指教

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10楼2018-09-14 11:56:05
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