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342667457

新虫 (小有名气)

[交流] p基因全长3’嘤嘤嘤 已有1人参与

研一小白p基因全长，est出了，3撇送测序回来有poly 结构但是blast 不是自己的基因。哭哭哭哭……设计引物的时候能用的不多，都不好用可怎么办，挑菌的时候我是不是要挑好多好多……

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1楼 2018-05-31 10:56:16
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用户晓晓

木虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
1，扩出来不是自己的基因说明你的引物特异性不行，那这样的话你的race条带应该也不是单一的，那就需要把另外的一些你认为是杂带的条带同样测序，可能里面有你需要的。
2，如果该基因不好设计引物的话，那你就利用基因组序列强行延长3‘端序列当做参考序列，然后设计引物利用cDNA进行扩增，碰运气，看看能不能延长3端序列，然后重新再确定的序列基础上再设计引物，看看是否可以避开非特异扩增。
3，大手笔，直接上三代全长转录组，测通该基因的所有全长转录本。

4，要是实在不行~~~兄弟，换课题吧~~~

祝试验顺利！
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2楼2018-05-31 11:24:41
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342667457

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 用户晓晓 at 2018-05-31 11:24:41
1，扩出来不是自己的基因说明你的引物特异性不行，那这样的话你的race条带应该也不是单一的，那就需要把另外的一些你认为是杂带的条带同样测序，可能里面有你需要的。
2，如果该基因不好设计引物的话，那你就利用基 ...

确实有杂带呢~我下次跑胶注意一下其他的带，谢谢大神第一次发帖，收到了这么全面的回复，感动

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3楼2018-05-31 15:20:43
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用户晓晓

木虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
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3楼: Originally posted by 342667457 at 2018-05-31 19:20:43
确实有杂带呢~我下次跑胶注意一下其他的带，谢谢大神第一次发帖，收到了这么全面的回复，感动
...

RACE实验确实还是比较考验人的一个，难度系数按说并不是很高，也有质量很高的试剂盒可以购买。但是真正做了才能感受到这个实验的难度，其实最主要的几个问题：1，跟你做的基因有太大的关系，有的基因很容易得到结果，有的基因累到死都做不出来。2，转录本比较复杂的基因也会影响 3，不好判断未知片段的长度，有可能非常大，扩不全，也有可能很短，捕捉不到条带。

但是其实3端应该是比较简单的，因为有一般有polyA。而真正困难的是5端扩增。
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4楼2018-05-31 16:36:18
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342667457

新虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 用户晓晓 at 2018-05-31 16:36:18
RACE实验确实还是比较考验人的一个，难度系数按说并不是很高，也有质量很高的试剂盒可以购买。但是真正做了才能感受到这个实验的难度，其实最主要的几个问题：1，跟你做的基因有太大的关系，有的基因很容易得到结果 ...

导师让做的两个基因都还没出3’    希望至少有一个能p出来吧，本来收到测序心情低落，收到大神细心的回复又有了信心

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5楼2018-05-31 16:54:04
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