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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 绝对定量 qPCR 标准曲线 数据分析
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qiaoqiao1223

新虫 (小有名气)

[交流] 绝对定量 qPCR 标准曲线 数据分析

最近在用qPCR测处理样品中的拷贝数，但是出现了不可避免的问题。。请教一下qPCR大神！谢谢！

我是将已知拷贝数的质粒梯度稀释，作标准曲线。用其CT值和拷贝数得到线性方程。然后将样品的CT值带入方程中，计算出样品中的拷贝数。每跑一组对照和处理，都会跑一次标曲，即同一板上有标准样品+对照组样品+处理组样品。（如：质粒中的拷贝数是10的7次方，6次方...到1次方，其CT值分别为a,b...g。在excel里将指数7,6,5,4,3,2,1和ct值a,b,c,d,e,f,g做散点图并生成线性方程，得到y=ax+b。然后将样品的ct值 X带入方程中，得到Y。这里的Y为10的指数，样品中的拷贝数为10的Y次方。）

但是这样做了几次发现，每次用标准样品得到的线性方程都会有微小的差异，算出来的处理样品中拷贝数会差很大。。请问这种误差怎么避免？（个人认为不能避免，因为每次加样会有误差，sybr效率和质粒浓度都会有微小差异。但是这种微小差异在计算的时候会被放大很多倍。我试过将同一个样品跑两次，即在两个板子上跑，用的所有东西都一样，但是最后算出的结果还是会差很多。）

我现在能想到的就是，取3组或者4组样品（因为我们的科研需要至少三次独立重复试验嘛），放在同一个板子上跑，用同一个标准样品作为参考。

但是这样做的问题就是。我的试验是不同时间点的。。我可以将A时间点的几组样品放一个板子上跑，也可以将B时间点的几组放一个板子上跑。但是，我怎么比较A和B这两个时间点的差异呢？
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1楼 2018-05-07 12:18:49
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zhengzheng7585

铜虫 (初入文坛)
★
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可以从以下方面考虑：用384孔板跑，或者一对一对的跑，或者用合适的统计学方法分析~
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23楼2018-05-24 13:27:34
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syhorchid2楼
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nono20093楼
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pqcdr90522楼
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