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huxuesong143

金虫 (初入文坛)

[交流] PCR产物问题

我要鉴定一只菌,初步定为放线菌,提出来的基因组跑胶后显示大于12000bp,而用16S通用引物克隆出来的,产物不一,用TAKARA ex Taq酶只产物1500bp一条,而用上海生工的pfu taq 酶产物有很多条,1000bp,800bp,500以下还有拖尾现象,请各位帮忙解答一下啊,谢了先啊。

[ Last edited by 350784478 on 2009-10-4 at 20:53 ]
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huxuesong143

金虫 (初入文坛)

附电泳条带图

各位,帮忙看看啊
2楼2009-03-22 13:05:06
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欣晴5832

金虫 (小有名气)

是不是Taq酶被污染了呀,你再查文献看看一般放线菌的16S有多大
3楼2009-03-22 16:28:06
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huxuesong143

金虫 (初入文坛)

引用回帖:
Originally posted by 欣晴5832 at 2009-3-22 16:28:
是不是Taq酶被污染了呀,你再查文献看看一般放线菌的16S有多大

我买的是不同公司的酶,新的,应该不存在污染的问题啊
4楼2009-03-25 22:05:44
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rommel1941

铁杆木虫 (正式写手)

情定山河

再优化一下条件看看
将相本无种★男儿当自强
5楼2009-03-25 22:44:12
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surui1109

铁虫 (初入文坛)

你基因组质量好象不是很好啊。还有PFU延伸效率不如TAQ高,也有可能出现杂带,提高下退火温度试试吧
6楼2009-03-31 11:03:42
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smallcat227

木虫 (著名写手)

就用TAKARA的不是挺好的么,后者的就是非特异性扩增嘛,1500bp用不着PFU
7楼2009-03-31 18:22:01
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hulqi

金虫 (正式写手)

同意7楼的,我也扩的1500的。建议直接用PCRMix
8楼2009-03-31 20:24:13
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elton_monkey

银虫 (初入文坛)

我们这都用ex taq扩增,产物大小要根据你通用引物的选择来看的吧。要是产物大小预计是1500bp的直接切胶回收测序就行了。
9楼2009-04-01 21:45:55
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wangtengxu

木虫 (正式写手)

1)pfu也可能有非特异性扩增
2)建议用pfu重新扩增,做个梯度PCR,提高退火温度,降低dNTP加入量
3)最好把你的gDNA质量提高下
想和有趣的人一起做有趣的事。
10楼2009-04-01 23:07:33
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