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双酶切构建pGADT7载体出问题？求助已有2人参与
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给位大神求指点 我目前正在构建一个pGADT7的载体。目的片段是1300bp（胶回收浓度不是很好20ng/ul左右），采用的双酶切方法，就是在目的条带两段设计引物的时候加上酶切位点。然后先连到 simple pEASY载体上测序。测序正确后，双酶切测序载体和pGADT7，然后过夜连接，次日大肠杆菌转化。做菌落PCR，在做菌落PCR的时候发现用特异性引物+载体引物能扩出来。用两个载体引物扩不出来。那应该就是没连上对吗？怎么解决呢？ 酶切体系50ul（用的全式金的EcoRI和BamHI)酶切目的条带时：PCR胶回收产物和连测序载体的都酶切了） DNA 5ul Buffer 5ul EcoRI 1ul BamHI 1ul ddH2O 38ul 37℃反应2小时 连接体系10ul(诺维赞的T4连接酶） 10*Buffer 2ul 片段 5ul 载体 0.5ul T4连接酶 1 ul ddH2O 11.5ul 反应条件16℃过夜连 拜托各位了。帮忙指出错误  |
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