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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 双酶切构建pGADT7载体出问题？求助
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18754802930

新虫 (初入文坛)

[求助] 双酶切构建pGADT7载体出问题？求助 已有2人参与

给位大神求指点
我目前正在构建一个pGADT7的载体。目的片段是1300bp（胶回收浓度不是很好20ng/ul左右），采用的双酶切方法，就是在目的条带两段设计引物的时候加上酶切位点。然后先连到 simple pEASY载体上测序。测序正确后，双酶切测序载体和pGADT7，然后过夜连接，次日大肠杆菌转化。做菌落PCR，在做菌落PCR的时候发现用特异性引物+载体引物能扩出来。用两个载体引物扩不出来。那应该就是没连上对吗？怎么解决呢？

酶切体系50ul（用的全式金的EcoRI和BamHI)酶切目的条带时：PCR胶回收产物和连测序载体的都酶切了）
DNA       5ul
Buffer     5ul
EcoRI      1ul
BamHI    1ul
ddH2O   38ul
37℃反应2小时

连接体系10ul(诺维赞的T4连接酶）
10*Buffer  2ul
片段           5ul
载体          0.5ul
T4连接酶   1 ul
ddH2O     11.5ul
反应条件16℃过夜连

拜托各位了。帮忙指出错误
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1楼 2018-04-16 11:12:07
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snhajn

新虫 (著名写手)
特异性引物+载体引物是什么意思，两个载体引物又是什么意思

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2楼2018-04-16 12:09:30
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18754802930

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by snhajn at 2018-04-16 12:09:30
特异性引物+载体引物是什么意思，两个载体引物又是什么意思

特异性引物是扩片段的引物
载体引物就是pGADT7的通用引物啊
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3楼2018-04-16 17:11:38
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diaomou

新虫 (小有名气)
通用引物形成二聚体？或者退火温度用的不合适？

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4楼2018-04-16 18:04:28
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diaomou

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
18754802930: 金币+1 2018-04-18 10:13:38
引用回帖:
4楼: Originally posted by diaomou at 2018-04-16 18:04:28
通用引物形成二聚体？或者退火温度用的不合适？

或者延伸时间不够？

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5楼2018-04-16 18:04:44
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18754802930

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by diaomou at 2018-04-16 18:04:44
或者延伸时间不够？
...

用 通用引物扩确实有引物二聚体。但是一点也没扩出来，感觉很不正常。我做了三个基因，都是这种情况。退火温度是根据引物来的，设置的60℃，应该也没问题吧？
那请问如果像您说的通用引物形成二聚体这种情况要怎么解决呢？
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6楼2018-04-16 19:06:02
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snhajn

新虫 (著名写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 18754802930 at 2018-04-16 17:11:38
特异性引物是扩片段的引物
载体引物就是pGADT7的通用引物啊...

这还真是不好解释呢，找到问题所在了一定要告知一下呢，哈哈

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7楼2018-04-17 19:48:01
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drwhoknowss

荣誉版主 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2018-04-18 08:24:10
18754802930: 金币+3 2018-04-18 10:12:37
18754802930: 金币+1 2018-04-18 10:14:06
用特异性引物+载体引物能扩出来，说明你克隆很可能是成功的。连上了
用两个载体引物扩不出来，原因有很多，比如片段太长，更可能的是你的引物不好用，就算没连上也会有比较小的带。
挑菌，提质粒，然后酶切或测序。
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Progress in science depends on new techniques, new discoveries and new ideas, probably in that order. -- Nobel laureate Sydney Brenner
8楼2018-04-17 23:26:17
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