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xingwei9830

新虫 (初入文坛)

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[交流] 求助！求助！求助！T载体转化问题

紧急求助啊！快崩溃了。请大家帮帮忙！
我最近在做大肠杆菌转化实验，基本过程是：
载体：pMD19 T载体
外源DNA为纯化的PCR产物（使用的Tap酶可在3·端加一个A）
宿主DH5a，
制备感受态DH5a；载体与外源DNA连接；转化DH5a，涂含有氨苄青霉素的平板，培养过夜，随机挑选5单克隆，菌落PCR电泳检测含有外源DNA的克隆，我用外源DNA特异性引物或T载体的通用引物，结果全是阴性结果。我重复做了3次转化了，结果还是阴性，不知道是为什啊，郁闷啊！

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1楼 2009-03-18 23:40:20

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轻5飞扬

金虫 (正式写手)

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★
xingwei9830(金币+1):谢谢参与

为什么是随机选啊,不是用蓝白筛么,好像PMD还比较好用吧很少有蓝班的
还有啊我觉得是不是你菌P做的不好,不行的话就提出质粒来酶切鉴定一下不就OK了么,菌P假阳性和假阴性都比较多,
你的菌P体系如何,列出来看看,有没有做阳性对照啊?

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2楼2009-03-19 01:43:59

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panqiuzhen

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要不然，先加A，再回收；或者用Promege T-easy载体。

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3楼2009-03-19 07:05:32

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xingwei9830

新虫 (初入文坛)

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我是用的蓝白斑筛选（可是没见到蓝斑），随机选得白斑，加1ml培养基（+AMP）37°c 培养4小时，取100微升菌液，沸水浴5min,12000r离心1min,取上清作为PCR模板。
PCR体系50ul:
TakraTap酶       0.25ul;
buffer             5ul;
Mg2+             3ul;
dNTP(各2.5mM)  4ul；
引物1             1ul;
引物2             1ul;
模板                2ul;
灭菌双蒸水       33.75 ul
对照组一是以纯化的外源DNA为模板，可以p出来；
对照组二是以M13通用引物，煮过的菌液上清为模板，没有p出来。

谢谢各位的指点啊！

[ Last edited by xingwei9830 on 2009-3-19 at 13:30 ]

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4楼2009-03-19 13:22:17

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