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求助！求助！求助！T载体转化问题
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紧急求助啊！快崩溃了。请大家帮帮忙！ 我最近在做大肠杆菌转化实验，基本过程是： 载体：pMD19 T载体 外源DNA为纯化的PCR产物（使用的Tap酶可在3·端加一个A） 宿主DH5a， 制备感受态DH5a；载体与外源DNA连接；转化DH5a，涂含有氨苄青霉素的平板，培养过夜，随机挑选5单克隆，菌落PCR电泳检测含有外源DNA的克隆，我用外源DNA特异性引物或T载体的通用引物，结果全是阴性结果。我重复做了3次转化了，结果还是阴性，不知道是为什啊，郁闷啊！ |
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铜虫 (小有名气)
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- 性别: GG
- 专业: 植物生理与生化
5楼2009-09-11 22:09:51
2楼2009-03-19 01:43:59
3楼2009-03-19 07:05:32
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我是用的蓝白斑筛选（可是没见到蓝斑），随机选得白斑，加1ml培养基（+AMP）37°c 培养4小时，取100微升菌液，沸水浴5min,12000r离心1min,取上清作为PCR模板。 PCR体系50ul: TakraTap酶 0.25ul; buffer 5ul; Mg2+ 3ul; dNTP(各2.5mM) 4ul； 引物1 1ul; 引物2 1ul; 模板 2ul; 灭菌双蒸水 33.75 ul 对照组一是以纯化的外源DNA为模板，可以p出来； 对照组二是以M13通用引物，煮过的菌液上清为模板，没有p出来。 谢谢各位的指点啊！ [ Last edited by xingwei9830 on 2009-3-19 at 13:30 ] |
4楼2009-03-19 13:22:17