| 查看: 611 | 回复: 5 | |||
| 当前主题已经存档。 | |||
| 当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖 | |||
[交流]
求助！求助！求助！T载体转化问题
|
|||
|
紧急求助啊！快崩溃了。请大家帮帮忙！ 我最近在做大肠杆菌转化实验，基本过程是： 载体：pMD19 T载体 外源DNA为纯化的PCR产物（使用的Tap酶可在3·端加一个A） 宿主DH5a， 制备感受态DH5a；载体与外源DNA连接；转化DH5a，涂含有氨苄青霉素的平板，培养过夜，随机挑选5单克隆，菌落PCR电泳检测含有外源DNA的克隆，我用外源DNA特异性引物或T载体的通用引物，结果全是阴性结果。我重复做了3次转化了，结果还是阴性，不知道是为什啊，郁闷啊！ |
回复此楼» 猜你喜欢
售SCI文章，我:8O5.5.1.O.54,科目齐全,可+急
已经有4人回复
-
小木虫上这么多卖论文的，真有人买论文么？感觉没必要啊
已经有12人回复
-
售SCI文章，我:8O.5.5.1O.54,科目全,可十急
已经有4人回复
-
售SCI一区文章，我:8O5.5.1.O5.4,科目全,可伽急
已经有4人回复
-
各位道友，我要去昆明玩几天，回来见。
已经有8人回复
-
售SCI一区T0P文章，我:8O.55.1.O.5.4,科目齐全,可+急
已经有4人回复
-
售SCI文章，我:8O5.5.1.O.54,科目齐全,可+急
已经有5人回复
-
售SCI一区T0P文章，我:8.O55.1.O.54,科目全,可十急
已经有7人回复
-
售SCI一区文章，我:8O5.5.1.O5.4,科目全,可伽急
已经有5人回复
-
售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可+急
已经有8人回复
3楼2009-03-19 07:05:32
2楼2009-03-19 01:43:59
|
我是用的蓝白斑筛选（可是没见到蓝斑），随机选得白斑，加1ml培养基（+AMP）37°c 培养4小时，取100微升菌液，沸水浴5min,12000r离心1min,取上清作为PCR模板。 PCR体系50ul: TakraTap酶 0.25ul; buffer 5ul; Mg2+ 3ul; dNTP(各2.5mM) 4ul； 引物1 1ul; 引物2 1ul; 模板 2ul; 灭菌双蒸水 33.75 ul 对照组一是以纯化的外源DNA为模板，可以p出来； 对照组二是以M13通用引物，煮过的菌液上清为模板，没有p出来。 谢谢各位的指点啊！ [ Last edited by xingwei9830 on 2009-3-19 at 13:30 ] |
4楼2009-03-19 13:22:17
88196861
铜虫 (小有名气)
- 应助: 0 (幼儿园)
- 金币: 100.2
- 帖子: 77
- 在线: 14.7小时
- 虫号: 302071
- 注册: 2006-12-02
- 性别: GG
- 专业: 植物生理与生化
5楼2009-09-11 22:09:51
