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baby1_9253344

金虫 (小有名气)

[求助] 单链DNA杂交退火冷却温度已有2人参与

请教各位,两个DNA单链杂交制备双链DNA时,95度退火5min之后,缓慢冷却(1h)至25度以下是如何控制实现的?如果没有缓慢冷却会有什么后果吗?
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cm14704019

至尊木虫 (知名作家)

2楼2018-04-03 14:27:23
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baby1_9253344

金虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by cm14704019 at 2018-04-03 14:27:23
自己试试就知道结果了

怎么验证?我目前就是没有能够控制1h内缓慢降温,不知道会对后续有什么影响,所以才发帖咨询。片段很小,大概50bp。我是打算杂交成有粘性末端的DNA双链片段,用来做连接反应的。
3楼2018-04-03 14:35:02
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GRUBBY_WU

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
drwhoknowss: 金币+1, 鼓励交流 2018-04-03 21:20:16
baby1_9253344: 金币+5, ★★★很有帮助 2018-04-04 10:44:50
肯定是可以的,我们之前做sgRNA就是合成的单链退火成有bbsi酶切位点的粘性末端,后来测序验证的。缓慢降温可以用pcr仪设置。

不用特意去验证最后有没有退火成双链,双酶切载体不自连,单酶切用cip处理下,能连接成功的基本都没问题,最后看测序结果。祝好
2019更好更棒!
4楼2018-04-03 15:30:32
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westcott0

新虫 (初入文坛)

你用一个金属加热器,在95度,关掉电源就行了

发自小木虫Android客户端
5楼2018-04-03 18:01:26
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drwhoknowss

荣誉版主 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
baby1_9253344: 金币+5, 有帮助 2018-04-04 10:43:45
缓慢冷却(1h)至25度的实现办法是:每分钟将5度。也就是设置PCR,每12秒降一度。具体设置,每个PCR不同,看说明吧
Progress in science depends on new techniques, new discoveries and new ideas, probably in that order. -- Nobel laureate Sydney Brenner
6楼2018-04-03 21:23:15
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baby1_9253344

金虫 (小有名气)

引用回帖:
5楼: Originally posted by westcott0 at 2018-04-03 18:01:26
你用一个金属加热器,在95度,关掉电源就行了

我用的就是PCR仪,95度加热之后关闭电源,但我感觉它温度冷却的非常快
7楼2018-04-04 10:46:53
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