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jessy_zxy

金虫 (小有名气)

[交流] 用枯草芽孢杆菌的菌液做qPCR做了个什么鬼出来啊

最近在对枯草芽孢杆菌做荧光定量PCR 实验，做了三批，每一批的扩增曲线都是直的，结果显示没有Ct 值，内参基因没有，目的基因也没有。第一批我直接在体系里加菌液，第二批将菌液沸水煮沸10min 再加入到反应体系里的，第三批直接用超声破碎处理菌液的。这么折腾都没有结果……还有一个很奇怪的点是有几个样没有Ct值却跑核酸胶显示有正确大小条带，很奇怪？
我怀疑是不是退火温度太高，于是将退火温度降低，还是没有Ct值，嗯，就是这么任性的没有！
我师兄说是不是直接上菌液太粗犷了？是不是直接提取全DNA 以此为模板才能扩增出来？
请问各位虫友们有直接用菌液做过qPCR 的吗？能否指教我一下，不甚感激！

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1楼2018-03-14 14:59:34
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zzchzj

新虫 (初入文坛)
★
jessy_zxy(金币+1): 谢谢参与
枯草的细胞壁那么厚，菌液不好扩出来

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13楼2019-07-19 11:46:17
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小朋友2335

新虫 (正式写手)
★
jessy_zxy(金币+1): 谢谢参与
我之前做的是提取RNA然后逆转录为cDNA作为模板进行荧光定量PCR，内参基因和目的基因出不出来，也和你设计的引物有关系吧

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2楼2018-04-09 23:19:17
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小朋友2335

新虫 (正式写手)
直接用菌液感觉模板环境太复杂了

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3楼2018-04-09 23:20:39
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忧伤的萤火虫

银虫 (初入文坛)
★
jessy_zxy(金币+1): 谢谢参与
菌液PCR是没有问题的，目前这种情况首先要确定你设计的引物是不是能够扩出来你的目的片段，建议先做个普通PCR，做个引物浓度梯度和退火温度梯度的实验，验证一下你引物的效率先。。。。
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4楼2018-04-17 12:22:56
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若晨、

新虫 (初入文坛)
★
jessy_zxy(金币+1): 谢谢参与
引用回帖:
2楼: Originally posted by 小朋友2335 at 2018-04-09 23:19:17
我之前做的是提取RNA然后逆转录为cDNA作为模板进行荧光定量PCR，内参基因和目的基因出不出来，也和你设计的引物有关系吧

引物如何重新设计？我也是做细菌的QPCR…内参Cq太小~4-5。目的基因太大32-36

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5楼2018-04-23 22:33:55
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jessy_zxy

金虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 小朋友2335 at 2018-04-09 23:20:39
直接用菌液感觉模板环境太复杂了

谢谢您，我已经以基因组为模板继续做下去了，菌液确实不能作为qPCR的好模板。

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7楼2018-10-20 17:10:15
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jessy_zxy

金虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 忧伤的萤火虫 at 2018-04-17 12:22:56
菌液PCR是没有问题的，目前这种情况首先要确定你设计的引物是不是能够扩出来你的目的片段，建议先做个普通PCR，做个引物浓度梯度和退火温度梯度的实验，验证一下你引物的效率先。。。。

谢谢您的回复，经过一系列验证，引物正常，反应条件也正常，模板换成基因组DNA后结果就很正常啦

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8楼2018-10-20 17:11:44
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wangpeijun

新虫 (文坛精英)
★
jessy_zxy(金币+1): 谢谢参与
加油

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9楼2019-06-05 16:28:03
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angkuLC

新虫 (初入文坛)
★
jessy_zxy(金币+1): 谢谢参与
引用回帖:
8楼: Originally posted by jessy_zxy at 2018-10-20 17:11:44
谢谢您的回复，经过一系列验证，引物正常，反应条件也正常，模板换成基因组DNA后结果就很正常啦
...

请问楼主“模板换成基因组DNA”是怎么操作的？怎么提取的基因组DNA？煮沸吗？
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14楼2021-10-15 17:31:03
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wdxmu6楼
2018-04-23 23:24   回复  
jessy_zxy(金币+1): 谢谢参与
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wangpeijun10楼
2019-07-04 16:47   回复  
wangpeijun11楼
2019-07-19 10:39   回复  
wang_qi12楼
2019-07-19 11:41   回复  
jessy_zxy(金币+1): 谢谢参与
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