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18795877368新虫 (初入文坛)
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基因敲除
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各位虫友大家好： 我最近开始酿酒酵母基因的敲除工作，采用的是G418抗性同源重组替换，现在遇到问题：已经筛选得到了转化子，并且能够在含G418液体培养液里生长，但在验证是出现问题，验证引物2对，（被敲基因上游一段A，含G418抗性基因中间一段Kb, ）（抗性基因中间Kc ,以及被敲基因下游一段D)，现在问题是A-kb能够p出基因 但条带较淡且含有杂带 ，Kc-D就不出来，还望有酿酒酵母敲除经验的虫友们多多指教！谢谢. |
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Dandyliujun
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3楼2018-01-30 23:59:41
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你好，本人最近也在做基因敲除。我做的是丝状真菌，之前也遇到过你的这种情况，我的处理办法是转化子纯化（单孢分离），然后重新提取基因组DNA，再次验证，搞定。我用的是split-marker重组。希望对你的实验有帮助。 现在我也遇到了一个问题，实验材料换成了其他的一个丝状真菌，同样用的是split-marker重组技术进行基因敲除，后期获得好多转化子，均能在潮霉素抗性的平板上生长，提取基因组验证后发现目标基因和潮霉素基因均存在，就是所谓的假阳性。后期也调整和优化了实验参数与方案，单并未解决这个问题。一次转化能得到100多个转化子，但是目的基因均未别敲除。 请问，你也遇到过类似的问题吗？请指教。谢谢 |
2楼2018-01-30 11:07:32
18795877368
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你好，我这个是已经划线挑单菌落提取了基因组来pcr的，一开始有条带，，不过大小不多，然后就以pcr产物为模板，再次pcr的，出现的2 3条条带，，其中包括了符合大小的条带，，请问这是什么原因呢，按道理如果没进去，都不应该有条带呢，，然后，你那个问题，我觉得一次转化子不会有那么多，会不会当中某个环节染了，我们之前也出现过的，都是把霉素倒掉重新配的， 发自小木虫Android客户端 |
4楼2018-02-01 11:14:25
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5楼2021-03-22 21:45:21
