应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » PCR出不来目的条带
61/1返回列表
查看: 1351  |  回复: 5
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

yuevis

铜虫 (小有名气)

[求助] PCR出不来目的条带

我想overlap pcr把上下同源臂和目的基因连在一起，从基提取的细菌基因组上扩增上下同源臂，没有目的条带，有很多比目的条带小或者接近的杂带，请问这是怎么回事啊，很急啊，我的引物是这样的
F1:AACTTGTGACGGAGGCG
R1:CTGACGTATAGATGACATAAGCCAGATCTGTCGCTTCGGTGC
F2:GCTTGCGAGAGGTTACCTGAACCGGCCGGAGCTGAC
R2:TTCCAGCGGAGTCCGA
重叠区25bp左右，primer给的Tm是52和54左右，合成单上是54和56度左右，我试了退火温度48，50，52，54，56效果都不好，杂带很多，目的条带有的没有，有的很淡。我之前想的是就算特异性不好，之后胶收就行了，现在是连条带都没有，用的是fastpfu酶，做的10微升体系。求教各位啊!

发自小木虫Android客户端
回复此楼

» 猜你喜欢
1楼 2017-11-29 23:16:40
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

wareer

铜虫 (小有名气)
体系也太小了吧，至少50微升。再者，你的酶也不太好。

发自小木虫Android客户端
赞一下 回复此楼
2楼2017-11-30 06:33:35
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

yuevis

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by wareer at 2017-11-30 06:33:35
体系也太小了吧，至少50微升。再者，你的酶也不太好。

刚开始做，很多不懂，我想的是那10微升试条件的，体系会有很大影响吗?还有出现很多杂带是不是说明提取的基因组和体系是没问题的?一般用什么酶?实验室只有fastpfu酶

发自小木虫Android客户端
赞一下 回复此楼
3楼2017-11-30 07:05:56
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

wareer

铜虫 (小有名气)
你这应该是要做载体的吧?用高保真的酶，引物设计可以用http://www.clontech.com/上面的infusion工具设计，我试过不错的。

发自小木虫Android客户端
赞一下 回复此楼
4楼2017-11-30 12:28:48
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

小洁癖0802

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
1楼: Originally posted by yuevis at 2017-11-29 23:16:40
我想overlap pcr把上下同源臂和目的基因连在一起，从基提取的细菌基因组上扩增上下同源臂，没有目的条带，有很多比目的条带小或者接近的杂带，请问这是怎么回事啊，很急啊，我的引物是这样的
F1:AACTTGTGACGGAGGCG
...

感觉是引物设计有问题，体系影响不大。是在做巢式PCR？所谓重叠区域25bp是两轮的差值？

发自小木虫Android客户端
赞一下 回复此楼
5楼2017-12-02 16:29:20
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

yuevis

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 小洁癖0802 at 2017-12-02 16:29:20
感觉是引物设计有问题，体系影响不大。是在做巢式PCR？所谓重叠区域25bp是两轮的差值？
...

不是巢式pcr，是overlap

发自小木虫Android客户端
赞一下 回复此楼
6楼2017-12-02 18:37:56
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 yuevis 的主题更新
61/1返回列表
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[公派出国] 售一区SCI文章T0P，我:8O.551.O54,科目全,可十急 +5 1uaZt2kAZj2S 2026-10-31 7/350 2026-11-01 16:58 by BCdvBAEpt3zm
[基金申请] 售SCI-T0P文章，我:8O.5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +6 X5bHxOULxFqb 2026-10-30 22/1100 2026-11-01 16:35 by BCdvBAEpt3zm
[考博] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.5.4,科目全,可+急 +3 hKe7U1kad5Sg 2026-10-31 7/350 2026-11-01 15:08 by BCdvBAEpt3zm
[基金申请] 售SCI一区文章，我:8.O.551.O.5.4,科目全,可伽急 +3 hKe7U1kad5Sg 2026-10-31 7/350 2026-11-01 15:04 by BCdvBAEpt3zm
[硕博家园] 售SCI一区文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可伽急 +3 hKe7U1kad5Sg 2026-10-31 6/300 2026-11-01 15:04 by BCdvBAEpt3zm
[考研] 售SCI一区文章，我:8O5.5.1.O5.4,科目全,可伽急 +4 xvJS1BYDxvBS 2026-10-31 10/500 2026-11-01 14:50 by BCdvBAEpt3zm
[硕博家园] 越来越担心硕士毕业后没有竞争力了 +9 zuesli 2026-10-27 15/750 2026-11-01 12:59 by Equinoxhua
[基金申请] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O54,科目全,可伽急 +3 xvJS1BYDxvBS 2026-10-31 3/150 2026-11-01 12:53 by BCdvBAEpt3zm
[考研] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.5.4,科目全,可+急 +3 xvJS1BYDxvBS 2026-10-31 5/250 2026-11-01 12:51 by BCdvBAEpt3zm
[基金申请] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可+急 +4 1uaZt2kAZj2S 2026-10-31 4/200 2026-11-01 12:38 by BCdvBAEpt3zm
[公派出国] 售SCI-T0P文章，我:8O.5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +3 1uaZt2kAZj2S 2026-10-30 7/350 2026-11-01 12:27 by BCdvBAEpt3zm
[硕博家园] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.5.4,科目全,可+急 +4 1uaZt2kAZj2S 2026-10-30 17/850 2026-11-01 12:24 by BCdvBAEpt3zm
[基金申请] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可+急 +4 1uaZt2kAZj2S 2026-10-30 11/550 2026-11-01 12:24 by BCdvBAEpt3zm
[教师之家] 售SCI-T0P文章，我:8O.5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +5 X5bHxOULxFqb 2026-10-30 15/750 2026-11-01 12:11 by BCdvBAEpt3zm
[硕博家园] 售SCI一区T0P文章，我:8O.55.1.O.54,科目全,可伽急 +4 X5bHxOULxFqb 2026-10-30 18/900 2026-11-01 12:11 by BCdvBAEpt3zm
[公派出国] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O54,科目全,可伽急 +3 hKe7U1kad5Sg 2026-10-31 5/250 2026-11-01 11:14 by BCdvBAEpt3zm
[考博] 售SCI一区文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可伽急 +3 xvJS1BYDxvBS 2026-10-31 4/200 2026-11-01 11:01 by BCdvBAEpt3zm
[硕博家园] 售SCI一区T0P文章，我:8.O55.1.O.54,科目全,可十急 +4 xvJS1BYDxvBS 2026-10-31 9/450 2026-11-01 10:53 by BCdvBAEpt3zm
[基金申请] 售SCI-T0P文章，我:8O.5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +3 1uaZt2kAZj2S 2026-10-30 14/700 2026-11-01 10:43 by BCdvBAEpt3zm
[论文投稿] 售一区SCI文章T0P，我:8O.551.O54,科目全,可十急 +3 1uaZt2kAZj2S 2026-10-31 8/400 2026-11-01 03:59 by YXM1FDCSE8Bn
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭