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yuevis铜虫 (小有名气)
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[求助]
PCR出不来目的条带
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我想overlap pcr把上下同源臂和目的基因连在一起，从基提取的细菌基因组上扩增上下同源臂，没有目的条带，有很多比目的条带小或者接近的杂带，请问这是怎么回事啊，很急啊，我的引物是这样的 F1:AACTTGTGACGGAGGCG R1:CTGACGTATAGATGACATAAGCCAGATCTGTCGCTTCGGTGC F2:GCTTGCGAGAGGTTACCTGAACCGGCCGGAGCTGAC R2:TTCCAGCGGAGTCCGA 重叠区25bp左右，primer给的Tm是52和54左右，合成单上是54和56度左右，我试了退火温度48，50，52，54，56效果都不好，杂带很多，目的条带有的没有，有的很淡。我之前想的是就算特异性不好，之后胶收就行了，现在是连条带都没有，用的是fastpfu酶，做的10微升体系。求教各位啊! 发自小木虫Android客户端 |
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2楼2017-11-30 06:33:35
yuevis
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刚开始做，很多不懂，我想的是那10微升试条件的，体系会有很大影响吗?还有出现很多杂带是不是说明提取的基因组和体系是没问题的?一般用什么酶?实验室只有fastpfu酶 发自小木虫Android客户端 |
3楼2017-11-30 07:05:56
4楼2017-11-30 12:28:48
5楼2017-12-02 16:29:20
yuevis
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6楼2017-12-02 18:37:56