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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » PCR出不来目的条带
北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
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yuevis

铜虫 (小有名气)

[求助] PCR出不来目的条带

我想overlap pcr把上下同源臂和目的基因连在一起，从基提取的细菌基因组上扩增上下同源臂，没有目的条带，有很多比目的条带小或者接近的杂带，请问这是怎么回事啊，很急啊，我的引物是这样的
F1:AACTTGTGACGGAGGCG
R1:CTGACGTATAGATGACATAAGCCAGATCTGTCGCTTCGGTGC
F2:GCTTGCGAGAGGTTACCTGAACCGGCCGGAGCTGAC
R2:TTCCAGCGGAGTCCGA
重叠区25bp左右，primer给的Tm是52和54左右，合成单上是54和56度左右，我试了退火温度48，50，52，54，56效果都不好，杂带很多，目的条带有的没有，有的很淡。我之前想的是就算特异性不好，之后胶收就行了，现在是连条带都没有，用的是fastpfu酶，做的10微升体系。求教各位啊!

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1楼 2017-11-29 23:16:40
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wareer

铜虫 (小有名气)
体系也太小了吧，至少50微升。再者，你的酶也不太好。

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2楼2017-11-30 06:33:35
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yuevis

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by wareer at 2017-11-30 06:33:35
体系也太小了吧，至少50微升。再者，你的酶也不太好。

刚开始做，很多不懂，我想的是那10微升试条件的，体系会有很大影响吗?还有出现很多杂带是不是说明提取的基因组和体系是没问题的?一般用什么酶?实验室只有fastpfu酶

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3楼2017-11-30 07:05:56
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wareer

铜虫 (小有名气)
你这应该是要做载体的吧?用高保真的酶，引物设计可以用http://www.clontech.com/上面的infusion工具设计，我试过不错的。

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4楼2017-11-30 12:28:48
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小洁癖0802

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
1楼: Originally posted by yuevis at 2017-11-29 23:16:40
我想overlap pcr把上下同源臂和目的基因连在一起，从基提取的细菌基因组上扩增上下同源臂，没有目的条带，有很多比目的条带小或者接近的杂带，请问这是怎么回事啊，很急啊，我的引物是这样的
F1:AACTTGTGACGGAGGCG
...

感觉是引物设计有问题，体系影响不大。是在做巢式PCR？所谓重叠区域25bp是两轮的差值？

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5楼2017-12-02 16:29:20
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yuevis

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 小洁癖0802 at 2017-12-02 16:29:20
感觉是引物设计有问题，体系影响不大。是在做巢式PCR？所谓重叠区域25bp是两轮的差值？
...

不是巢式pcr，是overlap

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6楼2017-12-02 18:37:56
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