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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 蛋白/酶 » 毕赤酵母分泌表达蛋白，没加任何标签的纯化方法
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zhaomsy

新虫 (初入文坛)

[求助] 毕赤酵母分泌表达蛋白，没加任何标签的纯化方法 已有1人参与

用毕赤酵母做的分泌型蛋白表达，目的蛋白的分子大小为6.5kD，当初设计的时候没有加his标签，求助用什么纯化方法进行纯化比较好？?因为需要尝蛋白所以需要纯化度好一点
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1楼 2017-11-16 13:05:11
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细胞资源

新虫 (初入文坛)
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2楼2017-11-21 14:55:58
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hc-material

专家顾问 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
zhaomsy: 金币+5 2017-11-24 21:01:35
没有标签，分泌表达的，纯化也简单，先硫酸铵盐析，这个既可以浓缩也可以粗纯，然后盐析后的蛋白溶解后，过疏水层析，进一步纯化，纯化后纯度不够了，在继续过离子交换的，阴阳离子试验下那个更合适，过完纯度890%应该没问题了，还想继续纯化，在过排阻层析，用葡聚糖G75柱子。没标签就用疏水，离子，排阻，盐析的方式纯化啊，也简单。
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3楼2017-11-22 09:25:30
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zhaomsy

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by hc-material at 2017-11-22 09:25:30
没有标签，分泌表达的，纯化也简单，先硫酸铵盐析，这个既可以浓缩也可以粗纯，然后盐析后的蛋白溶解后，过疏水层析，进一步纯化，纯化后纯度不够了，在继续过离子交换的，阴阳离子试验下那个更合适，过完纯度890%应 ...

目前做到阴离子交换，目的蛋白pI=5，想请教一下如何根据pI选择缓冲液和洗脱液呢
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4楼2017-11-24 21:03:51
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renyanbin

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by zhaomsy at 2017-11-24 21:03:51
目前做到阴离子交换，目的蛋白pI=5，想请教一下如何根据pI选择缓冲液和洗脱液呢...

缓冲液pH离PI远一些就可以，比如pH7.0/8.0的Tris，结合Buffer盐浓度20-50mM就可以，洗脱液可以先直接100%洗脱看看有没有条带，再优化。
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5楼2017-12-31 11:07:43
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dellxiong

金虫 (初入文坛)
请问楼主 6.5KD的蛋白分泌表达，好做吗？
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6楼2018-01-04 09:58:39
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zhaomsy

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by dellxiong at 2018-01-04 09:58:39
请问楼主 6.5KD的蛋白分泌表达，好做吗？

还好吧，就是跑15%的sds胶不太好跑，这个也跟分泌的蛋白浓度有关，能表达出来。
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7楼2018-01-05 14:49:43
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江灵敏

新虫 (小有名气)
我的也是毕赤酵母分泌蛋白，不过是50KD，跑蛋白胶没有目的蛋白，可以帮忙分析一下吗，关系到研究生毕业，谢谢

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8楼2018-04-17 22:52:07
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