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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » PEGFP-C1重组质粒转染细胞，G418筛选稳转细胞系遇到问题
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ocean_of_yu

木虫 (正式写手)

Cool

[求助] PEGFP-C1重组质粒转染细胞，G418筛选稳转细胞系遇到问题 已有4人参与

我做真核（鱼细胞系转染PEGFP-C1的重组质粒）稳定表达，用G418筛选，之前做了预筛选实验，测出了G418的筛选浓度，大约是900ug/ml， 现在用这个浓度做筛选，1个星期过后，不亮荧光的这些细胞（理论上没有转进去重组质粒）只有少部分细胞死亡，而且状态也挺好的，增殖也较快（当然比未转染的要慢），后来我就逐渐增加G418的浓度，一直到1800ug/ml了，也对细胞没什么影响。对照组（未转染的CHO细胞），用1000ul/ml这个浓度，只过5天，所有对照都死亡了。
现在我真的不知道原因是什么，细胞就是不死，我如何筛选呢？
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1楼 2017-11-08 14:16:29
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ywwabc

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
如果转染效率高的话就直接来个分选吧，分选有荧光的细胞培养；你那样的加药不死会不会是产生耐药性了？或者还是分成几组满满提高浓度吧！总有适合的浓度，前体是你最好冻存一点留个种，别到时候一下子有荧光的也死了就亏大了
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2楼2017-11-08 16:15:35
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世外清风

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
很正常的，大部分不死的细胞都是瞬时转染的，等到7天到8天后，没有插入的质粒被降解后，就会有大量细胞死亡的
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3楼2017-11-11 04:44:01
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世外清风

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
ocean_of_yu: 金币+10, ★有帮助 2017-11-17 15:53:41
部分不发光的是部分片段整合的，很正常
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4楼2017-11-11 04:45:26
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ocean_of_yu

木虫 (正式写手)

Cool
引用回帖:
4楼: Originally posted by 世外清风 at 2017-11-11 04:45:26
部分不发光的是部分片段整合的，很正常

你好，那如何确定是否整合了我的目的基因
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5楼2017-11-17 15:53:22
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世外清风

铁杆木虫 (职业作家)
引用回帖:
5楼: Originally posted by ocean_of_yu at 2017-11-17 15:53:22
你好，那如何确定是否整合了我的目的基因...

最简单的就是PCR了
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6楼2017-11-20 00:11:40
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wen191520

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

筛选细胞过程中，这个现象很正常。。。细胞状态，转染质粒浓度都会对其抗性有很大的影响，可以试着先按正常浓度900ug/ml处理7天后，换回400或200维持，一般都可以筛选出来
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7楼2017-12-18 22:17:50
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xuelong920

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

您好，看到你那里有PEGFP-C1质粒，我现在的实验需要这个质粒，不知道可否交换或者赠与我。真的非常感谢您 空质粒就可。
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8楼2018-04-09 15:35:27
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prthefu

木虫 (著名写手)
你好，楼主，最近做的实验跟你差不太多。
想咨询一个问题，pEGFP-C2质粒连接目的基因，想做稳转细胞系。
但是后来查到这个质粒瞬转可以，不适用于稳转，是这样吗？？
也咨询过公司，同样也是提到质粒不适用稳转，所以，懵了，不知道这个质粒到底能不能用于稳转细胞系构建了。
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nothing is impossible in this world，if you have the will to win，you can achieve anything
9楼2019-08-23 18:08:26
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