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ocean_of_yu

木虫 (正式写手)

Cool

[求助] PEGFP-C1重组质粒转染细胞,G418筛选稳转细胞系遇到问题 已有4人参与

我做真核(鱼细胞系转染PEGFP-C1的重组质粒)稳定表达,用G418筛选,之前做了预筛选实验,测出了G418的筛选浓度,大约是900ug/ml, 现在用这个浓度做筛选,1个星期过后,不亮荧光的这些细胞(理论上没有转进去重组质粒)只有少部分细胞死亡,而且状态也挺好的,增殖也较快(当然比未转染的要慢),后来我就逐渐增加G418的浓度,一直到1800ug/ml了,也对细胞没什么影响。对照组(未转染的CHO细胞),用1000ul/ml这个浓度,只过5天,所有对照都死亡了。
现在我真的不知道原因是什么,细胞就是不死,我如何筛选呢?
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ywwabc

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
如果转染效率高的话就直接来个分选吧,分选有荧光的细胞培养;你那样的加药不死会不会是产生耐药性了?或者还是分成几组满满提高浓度吧!总有适合的浓度,前体是你最好冻存一点留个种,别到时候一下子有荧光的也死了就亏大了
2楼2017-11-08 16:15:35
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世外清风

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
很正常的,大部分不死的细胞都是瞬时转染的,等到7天到8天后,没有插入的质粒被降解后,就会有大量细胞死亡的
3楼2017-11-11 04:44:01
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世外清风

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
ocean_of_yu: 金币+10, 有帮助 2017-11-17 15:53:41
部分不发光的是部分片段整合的,很正常
4楼2017-11-11 04:45:26
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ocean_of_yu

木虫 (正式写手)

Cool

引用回帖:
4楼: Originally posted by 世外清风 at 2017-11-11 04:45:26
部分不发光的是部分片段整合的,很正常

你好,那如何确定是否整合了我的目的基因
5楼2017-11-17 15:53:22
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世外清风

铁杆木虫 (职业作家)

引用回帖:
5楼: Originally posted by ocean_of_yu at 2017-11-17 15:53:22
你好,那如何确定是否整合了我的目的基因...

最简单的就是PCR了
6楼2017-11-20 00:11:40
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wen191520

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

筛选细胞过程中,这个现象很正常。。。细胞状态,转染质粒浓度都会对其抗性有很大的影响,可以试着先按正常浓度900ug/ml处理7天后,换回400或200维持,一般都可以筛选出来
7楼2017-12-18 22:17:50
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xuelong920

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

您好,看到你那里有PEGFP-C1质粒,我现在的实验需要这个质粒,不知道可否交换或者赠与我。真的非常感谢您 空质粒就可。
8楼2018-04-09 15:35:27
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prthefu

木虫 (著名写手)

你好,楼主,最近做的实验跟你差不太多。
想咨询一个问题,pEGFP-C2质粒连接目的基因,想做稳转细胞系。
但是后来查到这个质粒瞬转可以,不适用于稳转,是这样吗??
也咨询过公司,同样也是提到质粒不适用稳转,所以,懵了,不知道这个质粒到底能不能用于稳转细胞系构建了。
nothing is impossible in this world,if you have the will to win,you can achieve anything
9楼2019-08-23 18:08:26
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