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rongshuxia

木虫 (著名写手)

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专业: 微生物资源与分类学

[交流] 请教PCR扩增拖尾多带如何解决之

少部分样品，条带很好
大部分，出现拖尾多带等现象。

退火温度降落PCR 再扩增也试过了

目前准备：1、重新设计引物 2、做克隆，以前没做过，听说也不难

请教各位虫子高手，能否通过PCR扩出理想的目的片断？

[ Last edited by 350784478 on 2009-10-18 at 10:25 ]

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烦躁已经有5人回复
寻找合作团队已经有4人回复

1楼 2009-02-19 16:48:40

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diarylili

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我也遇到同样的问题，请教中

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2楼2009-02-19 16:57:39

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shenshanhaiguai

铁虫 (初入文坛)

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专业: 生物

应该是引物设计的问题吧，错配的位点太多了吧。

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3楼2009-02-19 17:29:27

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charon1982

铁杆木虫 (著名写手)

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lwf991229(金币+1,VIP+0):感谢参与讨论，欢迎常来~ 2-24 13:44

降低镁离子浓度试试，Mg2+是Taq DNA聚合酶活性所必需的,Mg2+浓度除影响酶活性与忠实性外,也影响引物的退火, 模板与PCR产物的解链温度,产物的特异性引物二聚体的形成等。Mg2+浓度过低时,酶活力明显降低;过高时,酶可催化非特异性扩增。PCR中Mg2+浓度在0.5～2.5mmol/L之间。如果溶液中存在EDTA,或在引物贮备液中有其他螯合物或者DNA模板,会干扰Mg2+的浓度。因此,要适当调整Mg2+的用量。

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帮助虫友，提升自己

4楼2009-02-19 18:29:57

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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)

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★
lwf991229(金币+1,VIP+0):感谢参与讨论，欢迎常来~ 2-24 13:44

模板量太高
酶量太高
退火温度太低
离子强度不合适（按说明书推荐的来）

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5楼2009-02-19 18:48:36

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jqq1985

银虫 (正式写手)

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专业: 生物大分子结构与功能

引物量减少点可以减少拖尾

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6楼2009-02-19 19:58:15

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icicle_me

铜虫 (初入文坛)

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lwf991229(金币+1,VIP+0):3Q~ 2-24 13:44

Heteroduplexes in mixed template amplifications formation consequence and elimination by reconditioning PCR
这篇文章有介绍，扩增不特异时可采用的方法：反应30个循环后，将原体系用新的体系稀释十倍后在扩增3个循环

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7楼2009-02-19 23:30:05

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