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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 请教PCR扩增拖尾 多带 如何解决之
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rongshuxia

木虫 (著名写手)
也就是降落PCR的逆向？？我理解没错吧？
引用回帖:
Originally posted by yumo at 2009-2-20 22:09:
前几天我也遇到过这样的问题。后来在一个相对低一点的温度先做了几个循环，再将温度提高到正常循环的温度就解决了这个问题。

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11楼2009-02-21 18:36:11
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chemifunan

木虫 (正式写手)

海王小木虫
★
lwf991229(金币+1,VIP+0):感谢参与讨论，~ 2-24 13:45
拖尾是不特异或者降解了 多带是不特异 重新合成引物不必 可以先检查一下每对引物之间的退火温度是否均衡（G+C*4 + A+T*2) 克隆与PCR无关 首先要P到理想的条带 然后连进质粒扩增的过程就是 它可以测序验证产物是否正确 不能解决PCR本身的问题

退火温度升高 升高到尽可能特异 然后克隆测序 模板不要加太多 延伸时间定住与目标长度相符 模板的RNA最好除干净
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12楼2009-02-21 21:59:40
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rongshuxia

木虫 (著名写手)
提高退火温度了，还是有多带和拖尾，再高就没条带了。

减少模板，条带也比原来变淡，尽管原来也不是特别亮。

我想按原来的条件扩出多带，比较亮，送测，让测序公司切胶或者自己切胶回收，做克隆，检测是否是我的目的片断。

有个问题，我要的目标片断里可能含有内含子，所以大小，我也不确定是多少。

原来的几株按这个温度，可以扩非常特异性的，很亮的单一条带。


是不是我的引物的问题呢？我也打算重新设计引物。。。。。。
引用回帖:
Originally posted by chemifunan at 2009-2-21 21:59:
拖尾是不特异或者降解了 多带是不特异 重新合成引物不必 可以先检查一下每对引物之间的退火温度是否均衡（G+C*4 + A+T*2) 克隆与PCR无关 首先要P到理想的条带 然后连进质粒扩增的过程就是 它可以测序验证产物是否 ...

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13楼2009-02-22 10:53:06
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小猫三两只

金虫 (正式写手)
引物减少,退火温度提高
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14楼2009-02-22 12:56:47
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wuchuqiu

铁虫 (小有名气)
除了上面的改进，建议你减少几个循环试试
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15楼2009-02-23 22:02:49
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rongshuxia

木虫 (著名写手)
谢谢！
我减少几个试i试

也在打算设计新的引物。。。。。。。。。。。。
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16楼2009-02-24 12:06:13
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chemifunan

木虫 (正式写手)

海王小木虫
楼主你的模板怎么会含有内含子 你直接用的GDNA是吗？ 你的菌没有CDNA文库吗？ 如果有粘粒或者BAC（我不知你是哪种真菌 有多大）尽量用文库的不要用GDNA 粘粒或者BAC上你的目标区域如果还是不能有效扩增 那就内切酶限制一下 缩小模板再P
不推荐你的方法 将所有送去让他们切胶 首先要有明确的条带 即使不是亚克隆 是原始克隆位置的东西 也要多少有明确大小的条带
如果不是以上问题 那就是PCR本身的问题了 检查一下灭过的水和Buffer 检查一下酶的使用条件
GC比有多高？ 高于60加DMSO
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17楼2009-02-24 12:14:18
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rongshuxia

木虫 (著名写手)
非常感谢楼上的MM的建议

提RNA经常碰到污染的问题吧 没做过 原来跟老板提过 老板没同意

您说的方法很好  
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18楼2009-02-25 11:27:46
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bioman9810

木虫 (著名写手)

千娇百媚是哥的妞儿
跟大家学习了
我也遇到过类的问题
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头搭毛巾也掩盖不住哥耀眼的光芒，哥一直帅的很低调，仰角45°深深陶醉中....
19楼2009-02-25 16:14:09
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