应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 请教PCR扩增拖尾 多带 如何解决之
192/2返回列表上一页12
查看: 1353  |  回复: 18
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
当前主题已经存档。

rongshuxia

木虫 (著名写手)
也就是降落PCR的逆向？？我理解没错吧？
引用回帖:
Originally posted by yumo at 2009-2-20 22:09:
前几天我也遇到过这样的问题。后来在一个相对低一点的温度先做了几个循环，再将温度提高到正常循环的温度就解决了这个问题。

赞一下 回复此楼
11楼2009-02-21 18:36:11
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

chemifunan

木虫 (正式写手)

海王小木虫
★
lwf991229(金币+1,VIP+0):感谢参与讨论，~ 2-24 13:45
拖尾是不特异或者降解了 多带是不特异 重新合成引物不必 可以先检查一下每对引物之间的退火温度是否均衡（G+C*4 + A+T*2) 克隆与PCR无关 首先要P到理想的条带 然后连进质粒扩增的过程就是 它可以测序验证产物是否正确 不能解决PCR本身的问题

退火温度升高 升高到尽可能特异 然后克隆测序 模板不要加太多 延伸时间定住与目标长度相符 模板的RNA最好除干净
赞一下(10人) 回复此楼
Bemühen Sie !
12楼2009-02-21 21:59:40
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

rongshuxia

木虫 (著名写手)
提高退火温度了，还是有多带和拖尾，再高就没条带了。

减少模板，条带也比原来变淡，尽管原来也不是特别亮。

我想按原来的条件扩出多带，比较亮，送测，让测序公司切胶或者自己切胶回收，做克隆，检测是否是我的目的片断。

有个问题，我要的目标片断里可能含有内含子，所以大小，我也不确定是多少。

原来的几株按这个温度，可以扩非常特异性的，很亮的单一条带。


是不是我的引物的问题呢？我也打算重新设计引物。。。。。。
引用回帖:
Originally posted by chemifunan at 2009-2-21 21:59:
拖尾是不特异或者降解了 多带是不特异 重新合成引物不必 可以先检查一下每对引物之间的退火温度是否均衡（G+C*4 + A+T*2) 克隆与PCR无关 首先要P到理想的条带 然后连进质粒扩增的过程就是 它可以测序验证产物是否 ...

赞一下 回复此楼
13楼2009-02-22 10:53:06
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

小猫三两只

金虫 (正式写手)
引物减少,退火温度提高
赞一下 回复此楼
14楼2009-02-22 12:56:47
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

wuchuqiu

铁虫 (小有名气)
除了上面的改进，建议你减少几个循环试试
赞一下 回复此楼
15楼2009-02-23 22:02:49
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

rongshuxia

木虫 (著名写手)
谢谢！
我减少几个试i试

也在打算设计新的引物。。。。。。。。。。。。
赞一下 回复此楼
16楼2009-02-24 12:06:13
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

chemifunan

木虫 (正式写手)

海王小木虫
楼主你的模板怎么会含有内含子 你直接用的GDNA是吗？ 你的菌没有CDNA文库吗？ 如果有粘粒或者BAC（我不知你是哪种真菌 有多大）尽量用文库的不要用GDNA 粘粒或者BAC上你的目标区域如果还是不能有效扩增 那就内切酶限制一下 缩小模板再P
不推荐你的方法 将所有送去让他们切胶 首先要有明确的条带 即使不是亚克隆 是原始克隆位置的东西 也要多少有明确大小的条带
如果不是以上问题 那就是PCR本身的问题了 检查一下灭过的水和Buffer 检查一下酶的使用条件
GC比有多高？ 高于60加DMSO
赞一下 回复此楼
Bemühen Sie !
17楼2009-02-24 12:14:18
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

rongshuxia

木虫 (著名写手)
非常感谢楼上的MM的建议

提RNA经常碰到污染的问题吧 没做过 原来跟老板提过 老板没同意

您说的方法很好  
赞一下 回复此楼
18楼2009-02-25 11:27:46
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

bioman9810

木虫 (著名写手)

千娇百媚是哥的妞儿
跟大家学习了
我也遇到过类的问题
赞一下 回复此楼
头搭毛巾也掩盖不住哥耀眼的光芒，哥一直帅的很低调，仰角45°深深陶醉中....
19楼2009-02-25 16:14:09
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 rongshuxia 的主题更新
192/2返回列表上一页12
普通表情 龙 兔 虎 猫 高级回复 (可上传附件)
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭