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rongshuxia

木虫 (著名写手)

[交流] 请教PCR扩增拖尾 多带 如何解决之

少部分样品,条带很好
大部分,出现拖尾 多带等现象。

退火温度 降落PCR  再扩增也试过了

目前准备:1、重新设计引物 2、做克隆,以前没做过,听说也不难

请教各位虫子高手,能否通过PCR扩出理想的目的片断?

[ Last edited by 350784478 on 2009-10-18 at 10:25 ]
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diarylili

我也遇到同样的问题,请教中
2楼2009-02-19 16:57:39
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shenshanhaiguai

铁虫 (初入文坛)

应该是引物设计的问题 吧,错配的位点太多了 吧。
3楼2009-02-19 17:29:27
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charon1982

铁杆木虫 (著名写手)


lwf991229(金币+1,VIP+0):感谢参与讨论,欢迎常来~ 2-24 13:44
降低镁离子浓度试试,Mg2+是Taq DNA聚合酶活性所必需的,Mg2+浓度除影响酶活性与忠实性外,也影响引物的退火, 模板与PCR产物的解链温度,产物的特异性引物二聚体的形成等。Mg2+浓度过低时,酶活力明显降低;过高时,酶可催化非特异性扩增。PCR中Mg2+浓度在0.5~2.5mmol/L之间。如果溶液中存在EDTA,或在引物贮备液中有其他螯合物或者DNA模板,会干扰Mg2+的浓度。因此,要适当调整Mg2+的用量。
帮助虫友,提升自己
4楼2009-02-19 18:29:57
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)


lwf991229(金币+1,VIP+0):感谢参与讨论,欢迎常来~ 2-24 13:44
模板量太高
酶量太高
退火温度太低
离子强度不合适(按说明书推荐的来)
5楼2009-02-19 18:48:36
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jqq1985

银虫 (正式写手)

引物量减少点可以减少拖尾
6楼2009-02-19 19:58:15
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icicle_me

铜虫 (初入文坛)


lwf991229(金币+1,VIP+0):3Q~ 2-24 13:44
Heteroduplexes in mixed template amplifications formation consequence and elimination by reconditioning PCR
这篇文章有介绍,扩增不特异时可采用的方法:反应30个循环后,将原体系用新的体系稀释十倍后在扩增3个循环
7楼2009-02-19 23:30:05
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rongshuxia

木虫 (著名写手)

谢谢!!!
引用回帖:
Originally posted by shenshanhaiguai at 2009-2-19 17:29:
应该是引物设计的问题 吧,错配的位点太多了 吧。

8楼2009-02-20 14:35:27
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rongshuxia

木虫 (著名写手)

文章下下来了,多谢!!

谢谢楼上的几位朋友
9楼2009-02-20 14:50:23
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yumo

新虫 (小有名气)

前几天我也遇到过这样的问题。后来在一个相对低一点的温度先做了几个循环,再将温度提高到正常循环的温度就解决了这个问题。
10楼2009-02-20 22:09:06
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