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小小小小小小柔

新虫 (初入文坛)

[求助] T4 DNA连接酶怎么提高连接效率 已有2人参与

我用T4 DNA 连接酶连接磷酸化以后的5'和3'的羟基,请问怎么提高连接效率。我用的条件是25℃过夜,酶浓度是DNA浓度的10倍,求大神指点

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晋鹏

版主 (知名作家)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
以T4连接酶进行连接的方法,这两种方法转化子比较多,阳性率也不错,唯一的不足就是连接的时间长。因为连接时间越长效率越高,一般快速连接方法需要半个小时到一个小时;达到最佳的效果,要过夜连接。

以拓扑异构酶(TOPO)进行连接的方法,这种方法的优势是快速连接,在5-15分钟就可以将目的基因克隆到载体中,阳性率比较高,这种方法国内也有人模仿。这种方法虽然速度快,但是也有一些缺陷,比如长片段连接效率不如T4连接酶,转化子少,TOPO酶对温度很敏感,稳定性较差。
及时行乐,人生不留遗憾!
2楼2017-10-09 21:19:53
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didongwei

金虫 (著名写手)

可以用Takara的solution I代替buffer试试

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不是优秀,而是不可替代
3楼2017-10-09 22:56:31
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小小小小小小柔

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
3楼: Originally posted by didongwei at 2017-10-09 22:56:31
可以用Takara的solution I代替buffer试试

我看有人说用聚乙烯醇也能增大连接效率,把buffer换了有什么区别吗

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4楼2017-10-11 10:33:20
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didongwei

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
引用回帖:
4楼: Originally posted by 小小小小小小柔 at 2017-10-11 10:33:20
我看有人说用聚乙烯醇也能增大连接效率,把buffer换了有什么区别吗
...

solutionI本身就含有连接酶,且buffer不一样,连接效率就有很大差别,有些稀有酶切位点连接效率低,可以试试这个方法,我之前换过后,连接成功了

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不是优秀,而是不可替代
5楼2017-10-11 10:39:33
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小小小小小小柔

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
5楼: Originally posted by didongwei at 2017-10-11 10:39:33
solutionI本身就含有连接酶,且buffer不一样,连接效率就有很大差别,有些稀有酶切位点连接效率低,可以试试这个方法,我之前换过后,连接成功了
...

但是我的目的是要测酶活性呀  换了怎么测 我还想问一下 你们做连接反应的时候里面有加一价的阳离子吗(比如 钠离子,钾离子)

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6楼2017-10-11 12:13:41
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