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[求助] T4 DNA连接酶怎么提高连接效率已有2人参与

我用T4 DNA 连接酶连接磷酸化以后的5'和3'的羟基，请问怎么提高连接效率。我用的条件是25℃过夜，酶浓度是DNA浓度的10倍，求大神指点

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1楼 2017-10-09 20:13:52

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晋鹏

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【答案】应助回帖

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以T4连接酶进行连接的方法，这两种方法转化子比较多，阳性率也不错，唯一的不足就是连接的时间长。因为连接时间越长效率越高，一般快速连接方法需要半个小时到一个小时；达到最佳的效果，要过夜连接。

以拓扑异构酶（TOPO）进行连接的方法，这种方法的优势是快速连接，在5-15分钟就可以将目的基因克隆到载体中，阳性率比较高，这种方法国内也有人模仿。这种方法虽然速度快，但是也有一些缺陷，比如长片段连接效率不如T4连接酶，转化子少，TOPO酶对温度很敏感，稳定性较差。