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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 生物化学 » T4 DNA连接酶怎么提高连接效率
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小小小小小小柔

新虫 (初入文坛)

[求助] T4 DNA连接酶怎么提高连接效率 已有2人参与

我用T4 DNA 连接酶连接磷酸化以后的5'和3'的羟基，请问怎么提高连接效率。我用的条件是25℃过夜，酶浓度是DNA浓度的10倍，求大神指点

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1楼 2017-10-09 20:13:52
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晋鹏

版主 (知名作家)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
以T4连接酶进行连接的方法，这两种方法转化子比较多，阳性率也不错，唯一的不足就是连接的时间长。因为连接时间越长效率越高，一般快速连接方法需要半个小时到一个小时；达到最佳的效果，要过夜连接。

以拓扑异构酶（TOPO）进行连接的方法，这种方法的优势是快速连接，在5-15分钟就可以将目的基因克隆到载体中，阳性率比较高，这种方法国内也有人模仿。这种方法虽然速度快，但是也有一些缺陷，比如长片段连接效率不如T4连接酶，转化子少，TOPO酶对温度很敏感，稳定性较差。
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及时行乐，人生不留遗憾！
2楼2017-10-09 21:19:53
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didongwei

金虫 (著名写手)
可以用Takara的solution I代替buffer试试

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不是优秀，而是不可替代
3楼2017-10-09 22:56:31
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小小小小小小柔

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by didongwei at 2017-10-09 22:56:31
可以用Takara的solution I代替buffer试试

我看有人说用聚乙烯醇也能增大连接效率，把buffer换了有什么区别吗

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4楼2017-10-11 10:33:20
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didongwei

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
引用回帖:
4楼: Originally posted by 小小小小小小柔 at 2017-10-11 10:33:20
我看有人说用聚乙烯醇也能增大连接效率，把buffer换了有什么区别吗
...

solutionI本身就含有连接酶，且buffer不一样，连接效率就有很大差别，有些稀有酶切位点连接效率低，可以试试这个方法，我之前换过后，连接成功了

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不是优秀，而是不可替代
5楼2017-10-11 10:39:33
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小小小小小小柔

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by didongwei at 2017-10-11 10:39:33
solutionI本身就含有连接酶，且buffer不一样，连接效率就有很大差别，有些稀有酶切位点连接效率低，可以试试这个方法，我之前换过后，连接成功了
...

但是我的目的是要测酶活性呀  换了怎么测 我还想问一下 你们做连接反应的时候里面有加一价的阳离子吗（比如 钠离子，钾离子）

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6楼2017-10-11 12:13:41
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