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吓成驴

新虫 (初入文坛)

[求助] 提质粒后的pcr产物回收为什么先双酶切然后再与酶切后的空载体连接？

小弟刚做双酶切，研究方向是片段缺失，提质粒后，用带酶切位点的上下引物做pcr，纯化后进行双酶切，然后再与双酶切过的载体连接。但是，我不明白；对质粒进行pcr后，不就是已经有了带酶切位点的目的片段了吗？为什么还要把这个做一个双酶切实验，然后再与已经双酶切后的空载体连接。为什么不可以吧纯化的pcr产物直接与双酶切后的空载体连接？纯化后的pcr产物做双酶切目的是什么啊？很困惑这个原理
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1楼 2017-10-05 20:51:44
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渊博震天

版主 (职业作家)

Yeast Display

优秀版主优秀版主
★
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2017-10-19 07:42:17
在质粒PCR的时候引入了酶切位点，同时引入酶切位点的同时也加了保护碱基，此时需要把保护碱基切掉露出酶切位点进行下一步连接

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2楼2017-10-05 21:19:29
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enjoy大志

铜虫 (小有名气)
★
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2017-10-19 07:42:35
主要的是暴露酶切位点，本身你的空载体的酶切位点已经暴露，pcr产物的酶切位点不暴露，是酶连不上的。一般流程：pcr获取目的片段—切胶回收获取纯化目的片段—双酶切获取空载体和暴露酶切位点的目的片段—切胶回收获取酶切产物—16度酶连过夜—转化—………

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付出定有回报
3楼2017-10-08 12:54:11
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吓成驴

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by enjoy大志 at 2017-10-08 12:54:11
主要的是暴露酶切位点，本身你的空载体的酶切位点已经暴露，pcr产物的酶切位点不暴露，是酶连不上的。一般流程：pcr获取目的片段—切胶回收获取纯化目的片段—双酶切获取空载体和暴露酶切位点的目的片段—切胶回收获 ...

谢谢，请问空载体提质粒酶切后，回收纯化完，载体质粒暴露的碱基不会被纯化掉吗？这时候纯化回收的酶切载体质粒，暴露的碱基不是双链不稳定啊

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4楼2017-10-09 00:36:39
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ugzecb036

木虫 (著名写手)
必须顶
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5楼2017-10-09 10:19:41
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反对派

银虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 吓成驴 at 2017-10-09 00:36:39
谢谢，请问空载体提质粒酶切后，回收纯化完，载体质粒暴露的碱基不会被纯化掉吗？这时候纯化回收的酶切载体质粒，暴露的碱基不是双链不稳定啊
...

基本的原理都不知道，如何做实验啊。你需要重新学习分子生物学课本的理论
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6楼2017-10-11 08:24:50
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chenjunpku

新虫 (初入文坛)
分子生物学没学就让做PCR，双酶切了？这孩子的老板心真大

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7楼2017-10-19 06:49:44
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123夏天456

新虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by chenjunpku at 2017-10-19 06:49:44
分子生物学没学就让做PCR，双酶切了？这孩子的老板心真大

哪一版的分子生物学呀

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8楼2017-11-02 19:25:51
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