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提质粒后的pcr产物回收为什么先双酶切然后再与酶切后的空载体连接？
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| 小弟刚做双酶切，研究方向是片段缺失，提质粒后，用带酶切位点的上下引物做pcr，纯化后进行双酶切，然后再与双酶切过的载体连接。但是，我不明白；对质粒进行pcr后，不就是已经有了带酶切位点的目的片段了吗？为什么还要把这个做一个双酶切实验，然后再与已经双酶切后的空载体连接。为什么不可以吧纯化的pcr产物直接与双酶切后的空载体连接？纯化后的pcr产物做双酶切目的是什么啊？很困惑这个原理 |
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西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2017-10-19 07:42:35
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2017-10-19 07:42:35
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主要的是暴露酶切位点，本身你的空载体的酶切位点已经暴露，pcr产物的酶切位点不暴露，是酶连不上的。一般流程：pcr获取目的片段—切胶回收获取纯化目的片段—双酶切获取空载体和暴露酶切位点的目的片段—切胶回收获取酶切产物—16度酶连过夜—转化—……… 发自小木虫IOS客户端 |
3楼2017-10-08 12:54:11
渊博震天
版主 (职业作家)
Yeast Display
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西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2017-10-19 07:42:17
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2017-10-19 07:42:17
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在质粒PCR的时候引入了酶切位点，同时引入酶切位点的同时也加了保护碱基，此时需要把保护碱基切掉露出酶切位点进行下一步连接 发自小木虫Android客户端 |
2楼2017-10-05 21:19:29
4楼2017-10-09 00:36:39
反对派
银虫 (正式写手)
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6楼2017-10-11 08:24:50