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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 小白白一枚，求助大神
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安宝贝

新虫 (小有名气)

[求助] 小白白一枚，求助大神

昨天做PCR，师兄让先练手，跟另外两个同学一起做，他们两个的待扩增片段都是1000多bp，我的是645bp，放在同一个PCR仪中，按照的是95℃5min.95℃30s，57℃45s，72℃1min，72℃10min，35个循环，其他两个同学扩增出的条带都很亮，我的目的条带就比较暗，不够回收，今天中午要重新做，求助大神我应该怎么设定程序提高特异性，让产物多一些。
引物F：Tm61.2℃，引物R：Tm62℃.GC含量:F40%多一点点，R不到40%，差一点点

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1楼 2017-09-26 07:50:31
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安宝贝

新虫 (小有名气)
体系50，水35，buffer5，dNTPs4，F2，R2，DNA1.5，taq0.5

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2楼2017-09-26 07:59:08
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yangmeng0711

新虫 (小有名气)
延伸时间长一点，退火温度和时间优化一下

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3楼2017-09-26 08:32:32
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安宝贝

新虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by yangmeng0711 at 2017-09-26 08:32:32
延伸时间长一点，退火温度和时间优化一下

能能具体点怎么优化么？我也知道是程序有问题

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4楼2017-09-26 09:04:13
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yangmeng0711

新虫 (小有名气)
★
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2017-09-27 07:46:35
退火温度以二度为梯度优化，退火时间根据你用的是什么酶上面有说明书，还有你模版的量，引物的量，包括你的延伸时间要根据你的目标基因长短而定，可以稍微长一点

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5楼2017-09-26 16:57:09
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安宝贝

新虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by yangmeng0711 at 2017-09-26 16:57:09
退火温度以二度为梯度优化，退火时间根据你用的是什么酶上面有说明书，还有你模版的量，引物的量，包括你的延伸时间要根据你的目标基因长短而定，可以稍微长一点

虽然师兄今天帮我设的程序跟你说的优化方法不太一样，还是谢谢你

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6楼2017-09-26 22:46:03
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夏老师的妹妹

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by yangmeng0711 at 2017-09-26 16:57:09
退火温度以二度为梯度优化，退火时间根据你用的是什么酶上面有说明书，还有你模版的量，引物的量，包括你的延伸时间要根据你的目标基因长短而定，可以稍微长一点

做touch down的时候用的是引物结合上去的低温度的那一个，想知道每个循环下降几度都有什么区别？这是为了什么？

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7楼2017-09-27 13:16:03
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