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jinkairui123

铁虫 (正式写手)

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[交流] 什么是抗体片段和抗体片段化

抗体片段化，就是用工具（蛋白酶及化学物质）将抗体分子切成特定大小的片段。Why？因为在实际运用时，抗体分子真的太大了！抗体分子的分子量一般为几百道尔顿（例如IgM五聚体就更庞大了），分子直径在10 nm~15 nm之间，而制备成抗体片段后，就呈现出各自的优势。

各类型抗体及抗体片段的分子量

抗体片段特性及功能
抗体片段化后，因去掉了某些功能结构域以及分子量的改变，具有与全长抗体不同的特性：
1、显著降低Fc的非特异性结合；
2、沉淀和免疫印迹中可降低抗体与proteinA、proteinG的结合；
3、更好的组织渗透性，免疫组化实验中染色效果更优异；
4、避免全长抗体的空间位阻效应，在固相抗原检测中灵敏度更高；
5、在抗原-抗体结合研究中可避免Fc相关作用因子的干扰；
6、X-射线晶体学或核磁共振研究免疫识别的结构基础时系统更加简化；
7、体内实验时相对全长抗体具有更低的免疫原性；
8、能偶联或结合酶、毒素、药物及放射性核素等。
抗体片段的这些优势可使其很好地应用于免疫化学技术、临床诊断及治疗等领域。

IgG、IgM各结构域功能及各片段的特性

IgG片段化工具
木瓜蛋白酶Papain
来源于女生最爱的水果—番木瓜，非特异性的巯基蛋白内切酶，分子量23 kDa，它在还原剂的存在下能将IgG切割成三个片段：2个Fab片段和1个Fc片段，最适反应pH6.5。木瓜蛋白酶最初是被用于制备Fab片段，不过它也可以用来制备F(ab')2片段，但是需要将其先用半胱氨酸活化，然后彻底去掉半胱氨酸再和IgG共同孵育。但是得到的F(ab')2片段并不均一，而且如果有半胱氨酸存在很容易过度切割。
胃蛋白酶Pepsin
由胃粘膜主细胞（gastric chief cell）分泌，非特异性的巯基蛋白内切酶，分子量35 kDa，它能将IgG切割成1个F(ab')2片段加Fc的多肽碎片（Fc’，可通过透析等方法除去），在中性及碱性环境下会不可逆失活，最适反应pH1.0。F(ab')2片段在温和的还原剂（如2-Mercaptoethylamine•HCl，2-MEA）作用下可得到2个单价的含巯基的Fab‘片段，这些片段因为自带巯基可以用来偶联检测标记物而不影响片段的结合活性，当然也可以用N-Ethylmaleimide (NEM)将巯基保护起来防止再次形成F(ab')2。
无花果蛋白酶
来源于无花果树的胶乳和不成熟的果实乳汁，非特异性的巯基蛋白酶，分子量26 kDa，它能在4 mM半胱氨酸的环境下将IgG切割成1个F(ab')2片段加Fc的多肽碎片（Fc’），或者在25 mM半胱氨酸的环境下将IgG切割成2个Fab片段加Fc的多肽碎片（Fc’），最适反应pH6.4。无花果蛋白酶水解IgG得到的F(ab')2片段大小与胃蛋白酶水解IgG得到的非常接近，而其免疫活性和亲和力则与全长IgG1抗体别无二致，在制备鼠类IgG1的片段时无花果蛋白酶是首选。

IgG的片段化

IgM片段化工具
不同种属的IgM片段化产物是有差异的，如鼠和人IgM在单体的连接方式上的不同导致二硫键位置的不同使得产物有差异，另外不同物种IgM上寡聚糖修饰的差异也会影响酶的切割，所以不同种属的IgM进行片段化需要不同的条件，没有一套通用的方案。
胃蛋白酶Pepsin：可将IgM切割成F(ab')2、Fab和Fv片段。
胰蛋白酶Trypsin：丝氨酸蛋白酶，最适反应pH8.0。可将IgM切割成F(ab')2、Fab、IgG型和Fc5片段。
化学试剂：2-MEA可将IgM处理成"IgG"型片段或/和还原型IgG ("rIgG"