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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 关于克隆
北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
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galaxy_6

超级版主

优秀！！有木有！！！优秀！！有木有！！！优秀！！有木有！！！优秀！！有木有！！！

[求助] 关于克隆

用已经确定含有目的片段的菌（经过克隆然后测序正确后扩大培养的菌）进行克隆，提取质粒后，进行PCR扩增，为什么不能扩增出目的片段出来呢？

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1楼 2017-09-20 07:50:35
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紫陌骚年的爱

兑换贵宾

优秀！！有木有！！！优秀！！有木有！！！优秀！！有木有！！！优秀！！有木有！！！
提取质粒作为模板，浓度要在10ng/ul 左右。请问，你稀释了吗？

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2楼2017-09-20 08:16:58
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法式小面包

超级版主

优秀！！有木有！！！优秀！！有木有！！！优秀！！有木有！！！优秀！！有木有！！！
菌放时间长了质粒可能会降解，也有可能是你PCR试剂的问题

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4楼2017-09-20 09:10:39
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不吃M的鱼

实习版主

优秀！！有木有！！！优秀！！有木有！！！优秀！！有木有！！！优秀！！有木有！！！
你这1ug的模板，电泳都能看到质粒条带了

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7楼2017-09-20 09:51:04
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不吃M的鱼

版主

优秀！！有木有！！！优秀！！有木有！！！优秀！！有木有！！！优秀！！有木有！！！
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8楼: Originally posted by galaxy_6 at 2017-09-20 09:54:39
是1μl
...

哦哦哦，那如果试剂没问题的话，模板可不可能污染了？其实不是你们的质粒了？可用用载体上通用引物测个序看看。质粒一般很好扩增的，我们模板用5ng，条带都贼亮贼亮的。

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9楼2017-09-20 09:59:38
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galaxy_6

实习版主

优秀！！有木有！！！优秀！！有木有！！！优秀！！有木有！！！优秀！！有木有！！！
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2楼: Originally posted by 紫陌骚年的爱 at 2017-09-20 08:16:58
提取质粒作为模板，浓度要在10ng/ul 左右。请问，你稀释了吗？

我们是加了1μ的模板，总体系是25μ，浓度应该没有问题，因为有个师姐也是这样扩增的。就有结果，我们的不同就在于所用的菌的培养时间不同，我的是以前的，她的是新摇的

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3楼2017-09-20 09:00:33
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galaxy_6

兑换贵宾

优秀！！有木有！！！优秀！！有木有！！！优秀！！有木有！！！优秀！！有木有！！！
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4楼: Originally posted by 法式小面包 at 2017-09-20 09:10:39
菌放时间长了质粒可能会降解，也有可能是你PCR试剂的问题

试剂不会有问题吧，因为我和那个师姐用的是同样的试剂

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5楼2017-09-20 09:17:43
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galaxy_6

实习版主

优秀！！有木有！！！优秀！！有木有！！！优秀！！有木有！！！优秀！！有木有！！！
引用回帖:
5楼: Originally posted by galaxy_6 at 2017-09-20 09:17:43
试剂不会有问题吧，因为我和那个师姐用的是同样的试剂
...

并且提取质粒后，电泳检测出来也是有质粒的

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6楼2017-09-20 09:20:46
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galaxy_6

兑换贵宾

优秀！！有木有！！！优秀！！有木有！！！优秀！！有木有！！！优秀！！有木有！！！
引用回帖:
7楼: Originally posted by 不吃M的鱼 at 2017-09-20 09:51:04
你这1ug的模板，电泳都能看到质粒条带了

是1μl

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8楼2017-09-20 09:54:39
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galaxy_6

版主

优秀！！有木有！！！优秀！！有木有！！！优秀！！有木有！！！优秀！！有木有！！！
引用回帖:
9楼: Originally posted by 不吃M的鱼 at 2017-09-20 09:59:38
哦哦哦，那如果试剂没问题的话，模板可不可能污染了？其实不是你们的质粒了？可用用载体上通用引物测个序看看。质粒一般很好扩增的，我们模板用5ng，条带都贼亮贼亮的。
...

嗯嗯，但是那个质粒本来就是从已经测了序之后，扩大培养里面的菌里提取出来的，这样污染的可能性应该不是太大吧！

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10楼2017-09-20 10:25:41
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