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北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
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饿的神啊

新虫 (著名写手)

[求助] 体外转录 已有1人参与

想要体外转录dsRNA，已经在上下游引物的5'端都加了T7启动子序列，但是胶回收得率很低，只有大概40ng/ul，远达不到体外转录试剂盒要求的起始模板量，所以想将PCR产物克隆到带T7启动子的载体上，比如pEASY-T1-simple，现在问题是这类的载体的T7启动子离插入片段都至少有几十bp的距离，我想问这几十bp的非目的片段是否会影响体外转录后生成的dsRNA，急求
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1楼 2017-09-15 11:27:07
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kangaroo0513

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
饿的神啊: 金币+20, ★★★很有帮助 2017-09-21 17:20:09
私觉得，后面有一串也没有太大问题，否则就没有神马载体可以用于转录了。
浓度低两个办法
1. 多切载体，多回收，回收的时候如果片段小于350bp，就在溶胶之后上柱之前加1/3体积的异丙醇。
2. 把你的目的片段放到载体里之后，用高保真酶进行PCR，然后挥手PCR产物，用于体外转录。
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2楼2017-09-15 13:17:26
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饿的神啊

新虫 (著名写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by kangaroo0513 at 2017-09-15 13:17:26
私觉得，后面有一串也没有太大问题，否则就没有神马载体可以用于转录了。
浓度低两个办法
1. 多切载体，多回收，回收的时候如果片段小于350bp，就在溶胶之后上柱之前加1/3体积的异丙醇。
2. 把你的目的片段放到载 ...

关于第2点，“ 把你的目的片段放到载体里之后，用高保真酶进行PCR，然后挥手PCR产物，用于体外转录”，目的片段放到载体里面后为什么还要PCR啊，不是直接线性化，然后纯化质粒就可以用作反转录模板了吗？
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3楼2017-09-15 14:48:44
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饿的神啊

新虫 (著名写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by kangaroo0513 at 2017-09-15 13:17:26
私觉得，后面有一串也没有太大问题，否则就没有神马载体可以用于转录了。
浓度低两个办法
1. 多切载体，多回收，回收的时候如果片段小于350bp，就在溶胶之后上柱之前加1/3体积的异丙醇。
2. 把你的目的片段放到载 ...

关于第2点，“ 把你的目的片段放到载体里之后，用高保真酶进行PCR，然后挥手PCR产物，用于体外转录”，目的片段放到载体里面后为什么还要PCR啊，不是直接线性化，然后纯化质粒就可以用作反转录模板了吗？
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4楼2017-09-15 14:48:59
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kangaroo0513

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
4楼: Originally posted by 饿的神啊 at 2017-09-15 14:48:59
关于第2点，“ 把你的目的片段放到载体里之后，用高保真酶进行PCR，然后挥手PCR产物，用于体外转录”，目的片段放到载体里面后为什么还要PCR啊，不是直接线性化，然后纯化质粒就可以用作反转录模板了吗？...

PCR产量大，我指的PCR是连T7和你的基因一起P下来。有些表达载体或者基因插入之后，质粒拷贝数会很低，这样还不如PCR产量高。。。
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5楼2017-09-15 16:46:09
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饿的神啊

新虫 (著名写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by kangaroo0513 at 2017-09-15 16:46:09
PCR产量大，我指的PCR是连T7和你的基因一起P下来。有些表达载体或者基因插入之后，质粒拷贝数会很低，这样还不如PCR产量高。。。...

哦，我打算用的是T载体，高拷贝的，应该不存在你说的那个问题的，谢谢提醒

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6楼2017-09-15 21:11:37
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魔兔考研

新虫 (初入文坛)
你好！求教一下引物设计的问题，使用什么软件？注意什么问题？我在上下游加了之后没出目的条带。谢谢

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7楼2017-11-19 18:30:46
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