应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 体外转录
北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
71/1返回列表
查看: 4872  |  回复: 6
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

饿的神啊

新虫 (著名写手)

[求助] 体外转录 已有1人参与

想要体外转录dsRNA，已经在上下游引物的5'端都加了T7启动子序列，但是胶回收得率很低，只有大概40ng/ul，远达不到体外转录试剂盒要求的起始模板量，所以想将PCR产物克隆到带T7启动子的载体上，比如pEASY-T1-simple，现在问题是这类的载体的T7启动子离插入片段都至少有几十bp的距离，我想问这几十bp的非目的片段是否会影响体外转录后生成的dsRNA，急求
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)
1楼 2017-09-15 11:27:07
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

kangaroo0513

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
饿的神啊: 金币+20, ★★★很有帮助 2017-09-21 17:20:09
私觉得，后面有一串也没有太大问题，否则就没有神马载体可以用于转录了。
浓度低两个办法
1. 多切载体，多回收，回收的时候如果片段小于350bp，就在溶胶之后上柱之前加1/3体积的异丙醇。
2. 把你的目的片段放到载体里之后，用高保真酶进行PCR，然后挥手PCR产物，用于体外转录。
赞一下 回复此楼
2楼2017-09-15 13:17:26
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

饿的神啊

新虫 (著名写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by kangaroo0513 at 2017-09-15 13:17:26
私觉得，后面有一串也没有太大问题，否则就没有神马载体可以用于转录了。
浓度低两个办法
1. 多切载体，多回收，回收的时候如果片段小于350bp，就在溶胶之后上柱之前加1/3体积的异丙醇。
2. 把你的目的片段放到载 ...

关于第2点，“ 把你的目的片段放到载体里之后，用高保真酶进行PCR，然后挥手PCR产物，用于体外转录”，目的片段放到载体里面后为什么还要PCR啊，不是直接线性化，然后纯化质粒就可以用作反转录模板了吗？
赞一下 回复此楼
3楼2017-09-15 14:48:44
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

饿的神啊

新虫 (著名写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by kangaroo0513 at 2017-09-15 13:17:26
私觉得，后面有一串也没有太大问题，否则就没有神马载体可以用于转录了。
浓度低两个办法
1. 多切载体，多回收，回收的时候如果片段小于350bp，就在溶胶之后上柱之前加1/3体积的异丙醇。
2. 把你的目的片段放到载 ...

关于第2点，“ 把你的目的片段放到载体里之后，用高保真酶进行PCR，然后挥手PCR产物，用于体外转录”，目的片段放到载体里面后为什么还要PCR啊，不是直接线性化，然后纯化质粒就可以用作反转录模板了吗？
赞一下 回复此楼
4楼2017-09-15 14:48:59
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

kangaroo0513

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
4楼: Originally posted by 饿的神啊 at 2017-09-15 14:48:59
关于第2点，“ 把你的目的片段放到载体里之后，用高保真酶进行PCR，然后挥手PCR产物，用于体外转录”，目的片段放到载体里面后为什么还要PCR啊，不是直接线性化，然后纯化质粒就可以用作反转录模板了吗？...

PCR产量大，我指的PCR是连T7和你的基因一起P下来。有些表达载体或者基因插入之后，质粒拷贝数会很低，这样还不如PCR产量高。。。
赞一下 回复此楼
5楼2017-09-15 16:46:09
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

饿的神啊

新虫 (著名写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by kangaroo0513 at 2017-09-15 16:46:09
PCR产量大，我指的PCR是连T7和你的基因一起P下来。有些表达载体或者基因插入之后，质粒拷贝数会很低，这样还不如PCR产量高。。。...

哦，我打算用的是T载体，高拷贝的，应该不存在你说的那个问题的，谢谢提醒

发自小木虫Android客户端
赞一下 回复此楼
6楼2017-09-15 21:11:37
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

魔兔考研

新虫 (初入文坛)
你好！求教一下引物设计的问题，使用什么软件？注意什么问题？我在上下游加了之后没出目的条带。谢谢

发自小木虫IOS客户端
赞一下 回复此楼
7楼2017-11-19 18:30:46
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 饿的神啊 的主题更新
71/1返回列表
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 一志愿南开大学0710生物学359求调剂 +3 兔兔兔111223314 2026-03-29 3/150 2026-03-29 23:14 by Evan_Liu
[考研] 085601材料工程找调剂 +14 oatmealR 2026-03-29 15/750 2026-03-29 21:48 by plmuchong
[考研] 材料与化工328分调剂 +7 。，。，。，。i 2026-03-23 7/350 2026-03-29 20:58 by 唐沐儿
[考研] 材料专硕调剂 +5 椰椰。 2026-03-29 5/250 2026-03-29 20:50 by 唐沐儿
[考研] 294分080500材料科学与工程求调剂 +8 柳溪边 2026-03-26 8/400 2026-03-29 20:42 by 唐沐儿
[考研] 一志愿南昌大学324求调剂 +5 hanamiko 2026-03-29 5/250 2026-03-29 16:46 by 学员8dgXkO
[考研] 070305高分子化学与物理 304分求调剂 +12 c297914 2026-03-28 12/600 2026-03-29 16:21 by Serene1974
[考研] 340求调剂 +6 Amber00 2026-03-26 6/300 2026-03-29 12:06 by 无际的草原
[考研] 求调剂，一志愿 南京航空航天大学 ，080500材料科学与工程学硕，总分289分 +7 @taotao 2026-03-29 7/350 2026-03-29 12:03 by longlotian
[考研] 279求调剂 +4 蝶舞轻绕 2026-03-29 4/200 2026-03-29 09:45 by laoshidan
[考研] 322求调剂 +7 宋明欣 2026-03-27 7/350 2026-03-28 21:27 by sanrepian
[考研] 一志愿北化085600材料专硕275|有文章专利｜求调剂 +7 Micky11223 2026-03-25 7/350 2026-03-28 18:34 by 无际的草原
[考研] 320分，材料与化工专业，求调剂 +9 一定上岸aaa 2026-03-27 13/650 2026-03-28 15:00 by 神马都不懂
[考研] 070300求调剂306分 +4 26要上岸 2026-03-27 4/200 2026-03-28 13:06 by 唐沐儿
[考研] 材料277求调剂 +7 min3 2026-03-24 7/350 2026-03-28 11:39 by xuxiang
[考研] 一志愿吉大071010，316分求调剂 +3 xgbiknn 2026-03-27 3/150 2026-03-27 10:36 by guoweigw
[考研] 317求调剂 +7 蛋黄咸肉粽 2026-03-26 7/350 2026-03-27 02:29 by fmesaito
[考研] 材料与化工304求B区调剂 +3 邱gl 2026-03-25 3/150 2026-03-25 19:03 by Ainin_
[考研] 求b区院校调剂 +4 周56 2026-03-24 5/250 2026-03-25 17:12 by yishunmin
[考研] 292求调剂 +4 鹅鹅鹅额额额额� 2026-03-24 4/200 2026-03-24 16:41 by peike
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭