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饿的神啊

新虫 (著名写手)

[求助] 体外转录已有1人参与

想要体外转录dsRNA,已经在上下游引物的5'端都加了T7启动子序列,但是胶回收得率很低,只有大概40ng/ul,远达不到体外转录试剂盒要求的起始模板量,所以想将PCR产物克隆到带T7启动子的载体上,比如pEASY-T1-simple,现在问题是这类的载体的T7启动子离插入片段都至少有几十bp的距离,我想问这几十bp的非目的片段是否会影响体外转录后生成的dsRNA,急求
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饿的神啊

新虫 (著名写手)

引用回帖:
2楼: Originally posted by kangaroo0513 at 2017-09-15 13:17:26
私觉得,后面有一串也没有太大问题,否则就没有神马载体可以用于转录了。
浓度低两个办法
1. 多切载体,多回收,回收的时候如果片段小于350bp,就在溶胶之后上柱之前加1/3体积的异丙醇。
2. 把你的目的片段放到载 ...

关于第2点,“ 把你的目的片段放到载体里之后,用高保真酶进行PCR,然后挥手PCR产物,用于体外转录”,目的片段放到载体里面后为什么还要PCR啊,不是直接线性化,然后纯化质粒就可以用作反转录模板了吗?
3楼2017-09-15 14:48:44
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kangaroo0513

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
饿的神啊: 金币+20, ★★★很有帮助 2017-09-21 17:20:09
私觉得,后面有一串也没有太大问题,否则就没有神马载体可以用于转录了。
浓度低两个办法
1. 多切载体,多回收,回收的时候如果片段小于350bp,就在溶胶之后上柱之前加1/3体积的异丙醇。
2. 把你的目的片段放到载体里之后,用高保真酶进行PCR,然后挥手PCR产物,用于体外转录。
2楼2017-09-15 13:17:26
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饿的神啊

新虫 (著名写手)

引用回帖:
2楼: Originally posted by kangaroo0513 at 2017-09-15 13:17:26
私觉得,后面有一串也没有太大问题,否则就没有神马载体可以用于转录了。
浓度低两个办法
1. 多切载体,多回收,回收的时候如果片段小于350bp,就在溶胶之后上柱之前加1/3体积的异丙醇。
2. 把你的目的片段放到载 ...

关于第2点,“ 把你的目的片段放到载体里之后,用高保真酶进行PCR,然后挥手PCR产物,用于体外转录”,目的片段放到载体里面后为什么还要PCR啊,不是直接线性化,然后纯化质粒就可以用作反转录模板了吗?
4楼2017-09-15 14:48:59
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kangaroo0513

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
4楼: Originally posted by 饿的神啊 at 2017-09-15 14:48:59
关于第2点,“ 把你的目的片段放到载体里之后,用高保真酶进行PCR,然后挥手PCR产物,用于体外转录”,目的片段放到载体里面后为什么还要PCR啊,不是直接线性化,然后纯化质粒就可以用作反转录模板了吗?...

PCR产量大,我指的PCR是连T7和你的基因一起P下来。有些表达载体或者基因插入之后,质粒拷贝数会很低,这样还不如PCR产量高。。。
5楼2017-09-15 16:46:09
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