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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 生物化学 » 测定酶活力的时候感觉酶总是没有和底物反应
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max小线

新虫 (初入文坛)

[求助] 测定酶活力的时候感觉酶总是没有和底物反应 已有2人参与

各位大神，最近做了一个月的酶活力测定，始终没有结果，想请教一下是不是哪个操作出了问题
反应体系如下：
ddH2O 300ul
17mM MgCl2 300ul
Tirs-HCL 200ul
100mM ATP 50ul
3mM COA 100ul
20mM 对-香豆酸 10ul
酶 40ul
MgCl2、Tirs、ATP、COA均用超纯水配制，对-香豆酸用2ml乙醇溶解后超纯水定容至25ml
MgCl2、Tirs、对-香豆酸、ATP溶液保存在4℃，COA溶液分装后保存在-20℃。
ATP粉末保存在4℃，COA粉末保存在-20℃。
反应温度为室温(25-28℃),反应时间为20min。
酶为重组蛋白，经纯化后马上进行活力测定，测动力学20min内吸光度几乎没有改变，反应完上液相检测也没有底物的峰。
我是真的快绝望了，希望大神能给一点帮助，感激不尽
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1楼 2017-09-05 17:35:02
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黄文元1

新虫 (小有名气)
测20min太长了吧，可能是20min时间太长，以至于数值看起来不明显

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2楼2017-09-05 17:54:55
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max小线

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 黄文元1 at 2017-09-05 17:54:55
测20min太长了吧，可能是20min时间太长，以至于数值看起来不明显

反应20min后跟0min的吸光度差不多

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3楼2017-09-05 18:06:53
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yangmeng0711

新虫 (小有名气)
没有酶呗

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4楼2017-09-05 21:09:23
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max小线

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by yangmeng0711 at 2017-09-05 21:09:23
没有酶呗

考马斯亮蓝g-250测定过酶浓度 1.7mg/ml

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5楼2017-09-05 21:46:40
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小郑555

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by max小线 at 2017-09-05 18:06:53
反应20min后跟0min的吸光度差不多
...

1.buffer PH不合适
2.反应时间可以在加长，HPLC检测有无产物
3.你确定你的酶有活性？都没有产物峰，就测动力学
4.测动力学就取初速度，测1-2min就可以了
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6楼2018-03-20 12:07:06
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jhoo

至尊木虫 (知名作家)

【答案】应助回帖

最好用粗酶液测定酶活力，由于酶具有专一性一般影响不大，对照的样品加钝化或灭活的酶，我觉得酶在纯化时可能温度，盐浓度，pH等几方面影响较大，你最好用粗酶进行性质研究一下，然后再进行纯化，粗酶能够测定活性，你那个纯化可能有问题，最好再找个有活力的粗酶做阳性对照，这样可以排除你的试剂和方法是否有问题，我觉得是你没有阳性对照（通常是采用同样方法可以测定的酶作为阳性对照），
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7楼2018-05-18 20:33:12
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