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金色海豚

金虫 (小有名气)

[求助] 求大神帮忙,质粒双酶切后条带很暗,几乎看不到!! 已有1人参与

我是将目的基因连接T载体后提取质粒,菌液pcr很正常,显示我转化成功了,质粒也是做了pcr鉴定的,显示已成功提取,可是采用双酶切鉴定质粒就是不行~~酶切体系10uL. 20uL和50uL我都试过了,就是没有条带,心好累啊,,求大神帮我分析下,感激不尽。。。。。@biostar2009
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zhouxfd

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
金色海豚: 金币+20, ★★★很有帮助, 多谢回复 2017-09-06 09:02:26
1.保证酶切体系内的质粒浓度大于300ng/ul
2.保证你用的酶里面没有DNase的污染

一般T载体有很高的copy,不可能出现你这种情况
5楼2017-09-03 04:45:33
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aishida

禁虫 (职业作家)

本帖内容被屏蔽

2楼2017-09-03 00:02:12
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aishida

禁虫 (职业作家)

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» 本帖已获得的红花(最新10朵)

3楼2017-09-03 00:05:15
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金色海豚

金虫 (小有名气)

引用回帖:
3楼: Originally posted by aishida at 2017-09-03 00:05:15
2.可以用两种酶分别酶切,确认酶是有效的 3.菌落pcr引物使用特异性引物和通用引物的组合试试  4.有条件的话使用agile 2200来跑胶,检测线是pg级别的

谢谢您的回复,我会好好采纳的~~我的目的片段是323bp。我提了几次质粒了都切不好,而且我也特意加大了菌液量,内切酶用的是takara的Xba1和Hind3,是新买的应该没问题。我明天再测一下质粒的量吧。。
4楼2017-09-03 00:21:08
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18253592055

金虫 (正式写手)

能测个浓度就测个浓度,其实所有的pcr都得排除你有没有污染,有带就不能说明是你要的带,最靠谱的是酶切验证和测序

发自小木虫IOS客户端
6楼2017-09-03 09:30:33
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1006641214

木虫 (正式写手)

wublab

你好
7楼2017-09-03 16:03:43
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金色海豚

金虫 (小有名气)

引用回帖:
5楼: Originally posted by zhouxfd at 2017-09-03 04:45:33
1.保证酶切体系内的质粒浓度大于300ng/ul
2.保证你用的酶里面没有DNase的污染

一般T载体有很高的copy,不可能出现你这种情况

好的,多谢您的回复~

发自小木虫Android客户端
8楼2017-09-06 08:52:05
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金色海豚

金虫 (小有名气)

引用回帖:
6楼: Originally posted by 18253592055 at 2017-09-03 09:30:33
能测个浓度就测个浓度,其实所有的pcr都得排除你有没有污染,有带就不能说明是你要的带,最靠谱的是酶切验证和测序

多谢回复~

发自小木虫Android客户端
9楼2017-09-06 08:52:35
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金色海豚

金虫 (小有名气)

送红花一朵
引用回帖:
3楼: Originally posted by aishida at 2017-09-03 00:05:15
2.可以用两种酶分别酶切,确认酶是有效的 3.菌落pcr引物使用特异性引物和通用引物的组合试试  4.有条件的话使用agile 2200来跑胶,检测线是pg级别的

很有帮助

发自小木虫Android客户端
10楼2017-09-06 08:59:53
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