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金色海豚

金虫 (小有名气)

[求助] 求大神帮忙，质粒双酶切后条带很暗，几乎看不到！！ 已有1人参与

我是将目的基因连接T载体后提取质粒，菌液pcr很正常，显示我转化成功了，质粒也是做了pcr鉴定的，显示已成功提取，可是采用双酶切鉴定质粒就是不行~~酶切体系10uL. 20uL和50uL我都试过了，就是没有条带，心好累啊，，求大神帮我分析下，感激不尽。。。。。@biostar2009
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1楼 2017-09-02 23:40:22
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aishida

禁虫 (职业作家)
本帖内容被屏蔽

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金色海豚 金色海豚
3楼2017-09-03 00:05:15
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aishida

禁虫 (职业作家)
本帖内容被屏蔽
2楼2017-09-03 00:02:12
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金色海豚

金虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by aishida at 2017-09-03 00:05:15
2.可以用两种酶分别酶切，确认酶是有效的 3.菌落pcr引物使用特异性引物和通用引物的组合试试  4.有条件的话使用agile 2200来跑胶，检测线是pg级别的

谢谢您的回复，我会好好采纳的~~我的目的片段是323bp。我提了几次质粒了都切不好，而且我也特意加大了菌液量，内切酶用的是takara的Xba1和Hind3，是新买的应该没问题。我明天再测一下质粒的量吧。。
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4楼2017-09-03 00:21:08
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zhouxfd

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
金色海豚: 金币+20, ★★★很有帮助, 多谢回复 2017-09-06 09:02:26
1.保证酶切体系内的质粒浓度大于300ng/ul
2.保证你用的酶里面没有DNase的污染

一般T载体有很高的copy，不可能出现你这种情况
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5楼2017-09-03 04:45:33
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