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北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
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临溪蜚蜚

新虫 (初入文坛)

[求助] 菌液PCRp不出来?!!! 已有9人参与

最近在做构建质粒的实验。我是以cDNA为模板p全长为1kb的基因,用连接产物转化DH5a,板上长的单克隆并不多,且菌落比较小,挑单克隆摇菌后进行菌液PCR,之后鉴定没有出现条带,阳性对照也没有条带,请问这种情况会是什么原因呢?载体已经去磷了,引物也没有错。希望知道的朋友能给解答一下,感激不尽!
PCR体系如下:
                                      10ul
                 菌液                2
               10Xbuffer        1
                 taq                0.2
                 dNTPs           0.75
                 F                    0.25
                 R                   0.25
                 ddH2O         5.55
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snoopytbw

荣誉版主 (著名写手)

【答案】应助回帖


西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2017-09-02 22:29:25
多半是目的片段没连接上,可能的错误有很多,我遇到过几次问题是连接酶体系的缓冲液有问题。其实PCR这些多半不太会错的。大部分原因总结下来都是缓冲液PH值有问题,不知道虫友有没有遇到同样的怪圈
15楼2017-08-30 14:17:18
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zhouxfd

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
临溪蜚蜚: 金币+2, 有帮助 2017-08-22 11:20:25
用提出的质粒鉴定是否阳性跟具有可信度,PCR不work证明你的体系有问题,建议通过阳性对照找到问题原因,比如换一下其他的酶试试
2楼2017-08-22 07:35:44
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781055707

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
临溪蜚蜚: 金币+2, 有帮助 2017-08-22 11:20:35
菌液最好不要超过0.5UL,里面的杂质会抑制PCR.但你2UL没P出来,也可能没连上。
采菊东篱下,悠然见南山。
3楼2017-08-22 07:55:58
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临溪蜚蜚

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by zhouxfd at 2017-08-22 07:35:44
用提出的质粒鉴定是否阳性跟具有可信度,PCR不work证明你的体系有问题,建议通过阳性对照找到问题原因,比如换一下其他的酶试试

“用提出的质粒鉴定是否阳性跟具有可信度” 请问这句话怎么理解,我没有提质粒,通过阳性对照找问题该怎么做呢?
4楼2017-08-22 09:01:33
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