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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 重叠延伸pcr的条件问题
北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
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memo989

铁虫 (初入文坛)

[求助] 重叠延伸pcr的条件问题 已有1人参与

希望将两个片段融合为一个片段，已扩增出单独的两个片段（两个片段有互补部分，约70bp）我的问题是，下一步如何融合？条件是什么？加的片段浓度要求是多少？

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1楼 2017-08-14 17:01:27
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xmcw765

新虫 (初入文坛)
片段1的上游引物加片段2的下游引物，按正常体系加

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2楼2017-08-14 19:25:20
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晋鹏

版主 (知名作家)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2017-08-15 07:04:25
方法可参考Nat Protoc. 2006;1(2):791-7.
PCR-based accurate synthesis of long DNA sequences.
文章里用overlap pcr将小片段组装成较大的片段。
个人感觉片段割胶回收后，在体系里每个片段加20纳克就足够了。
片段之间的overlap至少要有20bp，在50-55度退火。
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及时行乐，人生不留遗憾！
3楼2017-08-14 21:56:45
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memo989

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 晋鹏 at 2017-08-14 21:56:45
方法可参考Nat Protoc. 2006;1(2):791-7.
PCR-based accurate synthesis of long DNA sequences.
文章里用overlap pcr将小片段组装成较大的片段。
个人感觉片段割胶回收后，在体系里每个片段加20纳克就足够了。
...

谢谢！

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4楼2017-08-15 10:36:24
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memo989

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by xmcw765 at 2017-08-14 19:25:20
片段1的上游引物加片段2的下游引物，按正常体系加

模板加多少呢？

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5楼2017-08-15 10:58:31
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memo989

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by memo989 at 2017-08-15 10:58:31
模板加多少呢？
...

反应条件也和普通pcr一样吗？

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6楼2017-08-15 11:01:49
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ladejueshi

金虫 (正式写手)
70重叠，应该很好做了，两个模版加的摩尔比为1:1即可，其他条件一致

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7楼2017-08-15 11:11:09
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yvngqvx482
8楼2017-08-18 12:15:40
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pwxcqcr243
9楼2017-08-20 19:27:38
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yvngqvx482
10楼2017-08-21 12:38:45
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