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南方科技大学公共卫生及应急管理学院2026级博士研究生招生报考通知(长期有效)
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memo989

铁虫 (初入文坛)

[求助] 重叠延伸pcr的条件问题已有1人参与

希望将两个片段融合为一个片段,已扩增出单独的两个片段(两个片段有互补部分,约70bp)我的问题是,下一步如何融合?条件是什么?加的片段浓度要求是多少?

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xmcw765

新虫 (初入文坛)

片段1的上游引物加片段2的下游引物,按正常体系加

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2楼2017-08-14 19:25:20
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晋鹏

版主 (知名作家)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2017-08-15 07:04:25
方法可参考Nat Protoc. 2006;1(2):791-7.
PCR-based accurate synthesis of long DNA sequences.
文章里用overlap pcr将小片段组装成较大的片段。
个人感觉片段割胶回收后,在体系里每个片段加20纳克就足够了。
片段之间的overlap至少要有20bp,在50-55度退火。
及时行乐,人生不留遗憾!
3楼2017-08-14 21:56:45
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memo989

铁虫 (初入文坛)

引用回帖:
3楼: Originally posted by 晋鹏 at 2017-08-14 21:56:45
方法可参考Nat Protoc. 2006;1(2):791-7.
PCR-based accurate synthesis of long DNA sequences.
文章里用overlap pcr将小片段组装成较大的片段。
个人感觉片段割胶回收后,在体系里每个片段加20纳克就足够了。
...

谢谢!

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4楼2017-08-15 10:36:24
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memo989

铁虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by xmcw765 at 2017-08-14 19:25:20
片段1的上游引物加片段2的下游引物,按正常体系加

模板加多少呢?

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5楼2017-08-15 10:58:31
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memo989

铁虫 (初入文坛)

引用回帖:
5楼: Originally posted by memo989 at 2017-08-15 10:58:31
模板加多少呢?
...

反应条件也和普通pcr一样吗?

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6楼2017-08-15 11:01:49
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ladejueshi

金虫 (正式写手)

70重叠,应该很好做了,两个模版加的摩尔比为1:1即可,其他条件一致

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7楼2017-08-15 11:11:09
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8楼2017-08-18 12:15:40
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9楼2017-08-20 19:27:38
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10楼2017-08-21 12:38:45
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