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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 干扰/敲除 » 在构建RNA干扰载体中，目的片段与PLKO.1的连接问题
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胜哥的歌

新虫 (初入文坛)

[求助] 在构建RNA干扰载体中，目的片段与PLKO.1的连接问题 已有1人参与

新人求教
1、在合成我的干扰片段后（上海生工合成），发现目的片段的5`端是没有磷酸化的，而是羟基。因为在DNA连接时要形成3`-5`磷酸二酯键，这样目的片段和我的载体不是没有办法连接了？看了所有教程，都没有谈到5`端需要磷酸化，是不是默认合成的5端都没有磷酸化？

2、关于1的问题，我想到在单酶切载体，为了防止自身环化而用碱性磷酸酶把载体的5`端磷酸集团转为羟基，那目的片段再连接的时候是怎么连上的？
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1楼 2017-07-27 09:56:18
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wangranjun

荣誉版主 (知名作家)

广庭之惘然

优秀版主
引用回帖:
3楼: Originally posted by 胜哥的歌 at 2017-07-28 09:25:41
我用了同学给的TAKARA的T4PNK磷酸化，确实连上了。但是连上的经过酶切似乎不对。...

这个只能通过测序，连接上的片段很小，跑胶看不出来。
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» 本帖已获得的红花（最新10朵）

胜哥的歌
他日扬翼九万里，历大千世界，定我红尘心！
4楼2017-07-28 10:20:00
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wangranjun

荣誉版主 (知名作家)

广庭之惘然

优秀版主

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
连接之前不是需要用T4PNK处理一下的吗？
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他日扬翼九万里，历大千世界，定我红尘心！
2楼2017-07-27 14:18:14
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胜哥的歌

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by wangranjun at 2017-07-27 14:18:14
连接之前不是需要用T4PNK处理一下的吗？

我用了同学给的TAKARA的T4PNK磷酸化，确实连上了。但是连上的经过酶切似乎不对。
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3楼2017-07-28 09:25:41
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胜哥的歌

新虫 (初入文坛)
继续求教：
在拿到PLKO.1以后，我进行了第一次小提和大提，后面也插入了我自己连接的ShRNA片段。为了后续验证，在目的片段的设计中加入了一个KpnI酶切位点，原本载体上就有一个KpnI位点，那么如果我的目的片段成功连接，那只用KpnI就能切出一大一小两个片段，小片段1400左右。结果。。。。。我切出来的有2000.。。。。。。然后我返回去那我第一次大提的没有连接目的片段的载体切，KpnI切不出小片段，用KpnI+Agel也是2000！我晕了。。
按理说图谱上切下来小片段只有1400左右的
在构建RNA干扰载体中，目的片段与PLKO.1的连接问题
幻灯片1.PNG


在构建RNA干扰载体中，目的片段与PLKO.1的连接问题-1
2.png
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5楼2017-07-28 10:27:27
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