24小时热门版块排行榜    

Znn3bq.jpeg
汕头大学海洋科学接受调剂
查看: 2003  |  回复: 9
当前只显示满足指定条件的回帖,点击这里查看本话题的所有回帖

胜哥的歌

新虫 (初入文坛)

[求助] 在构建RNA干扰载体中,目的片段与PLKO.1的连接问题 已有1人参与

新人求教
1、在合成我的干扰片段后(上海生工合成),发现目的片段的5`端是没有磷酸化的,而是羟基。因为在DNA连接时要形成3`-5`磷酸二酯键,这样目的片段和我的载体不是没有办法连接了?看了所有教程,都没有谈到5`端需要磷酸化,是不是默认合成的5端都没有磷酸化?

2、关于1的问题,我想到在单酶切载体,为了防止自身环化而用碱性磷酸酶把载体的5`端磷酸集团转为羟基,那目的片段再连接的时候是怎么连上的?
回复此楼
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

wangranjun

荣誉版主 (知名作家)

广庭之惘然

优秀版主

引用回帖:
3楼: Originally posted by 胜哥的歌 at 2017-07-28 09:25:41
我用了同学给的TAKARA的T4PNK磷酸化,确实连上了。但是连上的经过酶切似乎不对。...

这个只能通过测序,连接上的片段很小,跑胶看不出来。

» 本帖已获得的红花(最新10朵)

他日扬翼九万里,历大千世界,定我红尘心!
4楼2017-07-28 10:20:00
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 10 个回答

wangranjun

荣誉版主 (知名作家)

广庭之惘然

优秀版主

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
连接之前不是需要用T4PNK处理一下的吗?
他日扬翼九万里,历大千世界,定我红尘心!
2楼2017-07-27 14:18:14
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

胜哥的歌

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by wangranjun at 2017-07-27 14:18:14
连接之前不是需要用T4PNK处理一下的吗?

我用了同学给的TAKARA的T4PNK磷酸化,确实连上了。但是连上的经过酶切似乎不对。
3楼2017-07-28 09:25:41
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

胜哥的歌

新虫 (初入文坛)

继续求教:
在拿到PLKO.1以后,我进行了第一次小提和大提,后面也插入了我自己连接的ShRNA片段。为了后续验证,在目的片段的设计中加入了一个KpnI酶切位点,原本载体上就有一个KpnI位点,那么如果我的目的片段成功连接,那只用KpnI就能切出一大一小两个片段,小片段1400左右。结果。。。。。我切出来的有2000.。。。。。。然后我返回去那我第一次大提的没有连接目的片段的载体切,KpnI切不出小片段,用KpnI+Agel也是2000!我晕了。。
按理说图谱上切下来小片段只有1400左右的
在构建RNA干扰载体中,目的片段与PLKO.1的连接问题
幻灯片1.PNG


在构建RNA干扰载体中,目的片段与PLKO.1的连接问题-1
2.png

5楼2017-07-28 10:27:27
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 291求调剂 +3 关忆北. 2026-04-14 3/150 2026-04-14 22:53 by 梁家伟
[考研] 材料工程085601,270求调剂 +42 @ASDF1234 2026-04-08 46/2300 2026-04-14 18:12 by 逍遥三郎
[考研] 297,工科调剂? +6 河南农业大学-能 2026-04-14 6/300 2026-04-14 16:04 by Art1977
[考研] 药学305求调剂 +10 玛卡巴卡boom 2026-04-10 10/500 2026-04-14 15:55 by zs92450
[考研] 085801电气专硕272求调剂 +14 电气李 2026-04-13 15/750 2026-04-14 14:58 by 逆水乘风
[考研] 一志愿中南大学 0855 机械 286 求调剂 +11 不会吃肉 2026-04-12 11/550 2026-04-13 21:59 by bljnqdcc
[考研] 一志愿鲁东大学071000生物学学硕初试分数276求调剂 +8 慕绝cc 2026-04-09 8/400 2026-04-13 14:08 by 张zhihao
[找工作] 山东高校教师考核超级无底线,员工过不下去啦 +4 qut2026 2026-04-09 9/450 2026-04-12 00:54 by qut2026
[考研] 22408调剂315分 +3 zhuangyan123 2026-04-09 3/150 2026-04-12 00:25 by 蓝云思雨
[考研] 284求调剂 +11 archer.. 2026-04-09 12/600 2026-04-11 20:23 by 蓝云思雨
[考研] 283求调剂 086004考英二数二 +17 那个噜子 2026-04-10 18/900 2026-04-11 16:27 by 明月此时有
[考研] 求调剂,一志愿大连理工大学354分 +5 雨声余生 2026-04-11 6/300 2026-04-11 16:12 by 雨声余生
[考研] 本人女孩 +7 吼吼, 2026-04-10 9/450 2026-04-11 14:45 by ACS Nano——
[考研] 283求调剂 +22 那个噜子 2026-04-09 22/1100 2026-04-11 10:41 by 逆水乘风
[考研] 调剂 化学 307 +21 73372112 2026-04-09 23/1150 2026-04-10 23:53 by wj165256
[考研] 263能源动力专硕求调剂 +4 加大号饭盒袋 2026-04-10 4/200 2026-04-10 20:52 by gong120082
[考研] 求机械专硕297第二批调剂 +5 拾柒12。 2026-04-08 5/250 2026-04-09 16:43 by 允当适度
[考研] 283电子信息求调剂 +4 三石WL 2026-04-08 4/200 2026-04-09 10:21 by wp06
[考研] 0860004 求调剂 309分 +6 Yin DY 2026-04-09 6/300 2026-04-09 10:19 by 啊李999
[考研] 296求调剂 +3 汪!?! 2026-04-08 3/150 2026-04-08 22:00 by zhouyuwinner
信息提示
请填处理意见