应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

Znn3bq.jpeg
小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 干扰/敲除 » 在构建RNA干扰载体中，目的片段与PLKO.1的连接问题
汕头大学海洋科学接受调剂
51/1返回列表
查看: 2001  |  回复: 9
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

胜哥的歌

新虫 (初入文坛)

[求助] 在构建RNA干扰载体中，目的片段与PLKO.1的连接问题 已有1人参与

新人求教
1、在合成我的干扰片段后（上海生工合成），发现目的片段的5`端是没有磷酸化的，而是羟基。因为在DNA连接时要形成3`-5`磷酸二酯键，这样目的片段和我的载体不是没有办法连接了？看了所有教程，都没有谈到5`端需要磷酸化，是不是默认合成的5端都没有磷酸化？

2、关于1的问题，我想到在单酶切载体，为了防止自身环化而用碱性磷酸酶把载体的5`端磷酸集团转为羟基，那目的片段再连接的时候是怎么连上的？
回复此楼

» 猜你喜欢
1楼 2017-07-27 09:56:18
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

wangranjun

荣誉版主 (知名作家)

广庭之惘然

优秀版主
引用回帖:
3楼: Originally posted by 胜哥的歌 at 2017-07-28 09:25:41
我用了同学给的TAKARA的T4PNK磷酸化，确实连上了。但是连上的经过酶切似乎不对。...

这个只能通过测序，连接上的片段很小，跑胶看不出来。
赞一下 回复此楼

» 本帖已获得的红花（最新10朵）

胜哥的歌
他日扬翼九万里，历大千世界，定我红尘心！
4楼2017-07-28 10:20:00
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 10 个回答

wangranjun

荣誉版主 (知名作家)

广庭之惘然

优秀版主

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
连接之前不是需要用T4PNK处理一下的吗？
赞一下 回复此楼
他日扬翼九万里，历大千世界，定我红尘心！
2楼2017-07-27 14:18:14
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

胜哥的歌

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by wangranjun at 2017-07-27 14:18:14
连接之前不是需要用T4PNK处理一下的吗？

我用了同学给的TAKARA的T4PNK磷酸化，确实连上了。但是连上的经过酶切似乎不对。
赞一下 回复此楼
3楼2017-07-28 09:25:41
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

胜哥的歌

新虫 (初入文坛)
继续求教：
在拿到PLKO.1以后，我进行了第一次小提和大提，后面也插入了我自己连接的ShRNA片段。为了后续验证，在目的片段的设计中加入了一个KpnI酶切位点，原本载体上就有一个KpnI位点，那么如果我的目的片段成功连接，那只用KpnI就能切出一大一小两个片段，小片段1400左右。结果。。。。。我切出来的有2000.。。。。。。然后我返回去那我第一次大提的没有连接目的片段的载体切，KpnI切不出小片段，用KpnI+Agel也是2000！我晕了。。
按理说图谱上切下来小片段只有1400左右的
在构建RNA干扰载体中，目的片段与PLKO.1的连接问题
幻灯片1.PNG


在构建RNA干扰载体中，目的片段与PLKO.1的连接问题-1
2.png
赞一下 回复此楼
5楼2017-07-28 10:27:27
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 10 个回答
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 通信工程求调剂！！！ +4 zlb770521 2026-04-14 4/200 2026-04-14 18:19 by lbsjt
[考研] 各位老师好，求调剂，本科211，一志愿天津大学生物与医药学硕，差两名录取。 +11 路六六jjj 2026-04-13 11/550 2026-04-14 16:01 by zs92450
[考研] 药学305求调剂 +10 玛卡巴卡boom 2026-04-10 10/500 2026-04-14 15:55 by zs92450
[考研] 296求调剂 +8 汪！？！ 2026-04-09 9/450 2026-04-14 15:15 by 逆水乘风
[考研] 生物学调剂 +11 小冉要努力 2026-04-10 13/650 2026-04-13 11:46 by 电化学及催化
[考研] 一志愿华工085600 331分 +7 天下ww 2026-04-09 7/350 2026-04-13 09:01 by lhj2009
[考研] 295分求调剂 +13 ?要上岸? 2026-04-10 13/650 2026-04-12 15:37 by laoshidan
[考研] 277 数一104，学硕，求调剂 +21 瓶子PZ 2026-04-09 23/1150 2026-04-11 23:12 by labixiaoqiao
[考研] 303求调剂 +14 SereinQ 2026-04-10 15/750 2026-04-11 20:43 by 蓝云思雨
[考研] 本人女孩 +7 吼吼， 2026-04-10 9/450 2026-04-11 14:45 by ACS Nano——
[考研] 0854调剂 +5 音像店听花鼓戏 2026-04-10 5/250 2026-04-11 10:49 by qingpingzhu
[考研] 293求调剂 +6 勇远库爱314 2026-04-08 6/300 2026-04-11 10:08 by zhq0425
[考研] 22408 327分求调剂 +4 韵风kon 2026-04-10 4/200 2026-04-11 09:51 by 猪会飞
[考研] 一志愿北理工298英一数二已上岸，感谢各位老师 +14 Reframe 2026-04-10 16/800 2026-04-10 23:07 by caotw2020
[考研] 一志愿京区985，085401电子信息，本科电子信息 +3 阳光开朗的男孩 2026-04-10 3/150 2026-04-10 16:29 by sophia_93
[考研] 296求调剂 +6 汪！？！ 2026-04-08 6/300 2026-04-10 11:02 by mattzhming
[考研] 调剂申请086000一志愿西北农林科技大学生物与医药320分-本科齐鲁工业大学 +3 美美女士 2026-04-09 3/150 2026-04-10 10:31 by liuhuiying09
[考研] 初试分332，一志愿报考西北工业大学， +11 故人?? 2026-04-09 11/550 2026-04-09 21:54 by JineShine
[考研] 085801 总分275 本科新能源 求调剂 +8 bradoner 2026-04-08 9/450 2026-04-09 13:43 by only周
[考研] 求调剂 +3 猪肉墩粉条cc 2026-04-08 4/200 2026-04-09 10:05 by 猪肉墩粉条cc
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭