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美不美先看腿金虫 (小有名气)
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谷氨酰胺合成酶测定 已有1人参与
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谷氨酰胺合成酶测定时以反应液A为对照，那调零是用哪个呢？酶活性和可溶性蛋白关系时负相关吗，公式又是如何计算的呢？ |
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yanchao504
铁虫 (正式写手)
晋鹏: 屏蔽内容, 求助帖子，禁止闲聊无关内容~ 2017-08-02 15:03:39
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2楼2017-07-23 08:11:41
晋鹏
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【答案】应助回帖
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剑叶硝酸还原酶（NR）活性的测定 采用活体法测定。 谷氨酰胺合成酶（GS）活性的测定 称取籽粒1g于研钵中，加3ml提取缓冲液（0.05mol/L Tris-HCl，pH8.0），置冰浴上研磨匀浆，转移于离心管中，4℃下16114×g离心20min，上清液即为粗酶液。在1.6mL反应混合液（0.1mol/L Tris-HCl缓冲液，80mol/L盐酸羟胺，pH7.4）中，加入0.7mL粗酶液和0.7mL 40mmol/L ATP溶液，混匀，于37℃下保温0.5h，加入显色剂（0.2mol/L TCA，0.37mol/LFeCl3和0.6mol/L HCl混合液）1mL，摇匀并放置片刻后，于1790×g下离心10min，取上清液测定540nm处的吸光值，以加入1.6mL反应混合液（0.1mol/L Tris-HCl缓冲液，pH7.4）为对照。 谷氨酸合成酶（GOGAT）活性的测定 参照Lin（1996）的方法，反应混合物总体积3mL（内含0.4mL 20mML-谷氨酰胺，0.05mL 0.1Mα-酮戊二酸，0.1mL 10mMKCl，0.2mL3mM NADH和0.5mL酶液，不足体积用25mM pH7.6 Tris-HCl缓冲液补足），反应由L-谷氨酰胺启动，340nm下测定消光值的变化。1min下降的消光值作为一个酶活性单位。 谷氨酸脱氢酶（GDH）活性的测定 参照Lin（1996）的方法。称取鲜样1.000g置于预先冷冻过的研钵中，加入少量石英砂和6mL提取液（10mMTris-HCl缓冲液，pH7.6，内含1mMMgCl2，1mMEDTA和1mM的β-巯基乙醇），冰浴下研磨至匀浆，倒入离心管，4℃下15000×g离心30min，上清液即为酶液。反应混合物中包括0.3mL0.1mMα-酮戊二酸，0.3mL1MNH4Cl，0.2mL3mMNADH和1mL酶提取液，不足体积用0.2MTris-HCl缓冲液补足，反应由酶液启动，340nm下测定消光值的变化。1min下降的消光值作为一个酶活性单位。 根据测定对象，每个方法中得样品量可以减少。 |
3楼2017-07-23 09:21:26
美不美先看腿
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