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yexiaoqi7

银虫 (小有名气)

[求助] 叶片中谷氨酸合酶和谷氨酰胺合成酶

请问哪位高人有测定植株中谷氨酸合酶及谷氨酰胺合成酶的具体方法啊？
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用心去看世界
1楼 2012-08-07 21:44:04
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zhaofeng8866

银虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

4.3 谷酰胺合成酶（GS）的测定：
方法1：
O.25mol／L 咪唑-盐酸缓冲液(pH7.0)：
O.30mol／L 谷氨酸钠溶液(pH7.O)：
30mmol／L ATP—Na溶液(pH7.O)：
O.5mol／L MgS04溶液：
羟胺试剂：
FeCl3溶液：
测定酶活性反应液组成如下：0.6ml咪唑-盐酸缓冲液(O．25mol／L，pH7.0),0.4ml谷氨酸钠溶液(O.30mol／L，pH7.O)，0.4ml ATP—Na溶液(30mmol／L，pH7.O)，0.2ml MgS04溶液(O.5mol／L)，酶粗液1.2ml。反应液在25℃水浴中保温5 min后，加入0.2 ml羟胺试剂开始反应，15 min后立即加入0.8 ml酸性FeCl3试剂终止反应。混合液在4000 r／min离心15 min，测定上清液在540nm处的光密度。一个GS活性单位定义为该反应条件下，在15min反应时间内催化形成1µmol r-谷氨酰异羟肟酸需要的酶量，总活性为：每克鲜样酶粗液在15min的反应时间内催化形成r-谷氨酰异羟肟酸的µmol数。（参考王小纯，熊淑萍，马新明，张娟娟，王志强的《不同形态氮素对专用型小麦花后氮代谢关键酶活性及籽粒蛋白质含量的影响》）
方法2：
酶活性反应液组成为：0.6 ml咪唑-盐酸缓冲液，0.4 ml谷氨酸钠溶液，0.4 ml ATP-Na溶液(30 mmol/L，pH 7．0)，MgSO4溶液(0.5 mol/L )，酶提取液1.2 ml。反应液0.2 ml在25℃水浴中保温 5 min，加入0.2 ml羟胺试剂开始反应。在25℃水浴中反应15min，加入0.8 ml反应终止液。混合液在4000×g离心15 min，在540 nm处测定上清液的光密度。一个GS活性单位定义为在该反应条件下，15 min反应时间内每克鲜重光密度的数值。（参考马新明，李琳，赵鹏，熊淑萍，郭飞的《土壤水分对强筋小麦‘豫麦34’氮素同化酶活性和籽粒品质的影响》）
方法3：（参考赵志杰，史国安，董新纯编的《植物生理学实验指导》）


方法4：依次取lml 咪唑-盐酸缓冲液、0．5mol／L MgCl•6H20、50mmol／L EDTA—Na 、lmol／L Glu—Na 、0．498mmol／L盐酸羟胺各0．2mL放入试管中，在迅速加入lmL粗酶液混匀， 于30cC水浴上反应15min，然后立即取出，加入lmL终止显色液(0.37mol／L FeC1 、0.67mol／L三氯乙酸、0.2moL／L HC1)终止反应，在5000r／min下离心10min，取上清液测540nm处消光值，对照在加完所有反应液后，先加入lmL终止显色液，再加入lmL粗酶液，对照管的其余步骤与测试管相同。对照标准曲线求出r-谷氨酰胺基羟肟酸的生成量，计算酶的活性。（参考赵越，魏自民，马凤鸣的《不同水平铵态氮对甜菜硝酸还原酶和谷氨酰胺合成酶活力的影响》）

4.4 谷氨酸合酶（GOGAT）的测定：
反应混合液包括0.4ml 20mmol／L的 L-谷氨酰胺，0.5ml 20mmol／L的a一酮戊二酸，0.1ml 10mmol／L的KCl，0.2ml 3mmol／L NADH和0.3ml酶液，总体积3.0ml，不足部分用25mmol／L的Tris-HCI缓冲液(pH7.6)补足(1．5m1)。反应启动后，用752紫外可见分光光度计于340nm处每30s测定1个消光值，连续测定11次，取光密度稳定减小的一段来衡量酶活性。一个GOGAT活性单位定义为在该反应条件下，每分钟反应混合液减少1µmolNADH为一个酶活性单位。（参考王小纯，熊淑萍，马新明，张娟娟，王志强的《不同形态氮素对专用型小麦花后氮代谢关键酶活性及籽粒蛋白质含量的影响》）

4.5 谷氨酸脱氢酶(GDH) 的测定：
提取液：0.2 mmol／L pH 8.2 Tris-HCl缓冲液。
反应液A：1.6µmol／L NAD + 360µmol／L Tris-HC1缓冲液。
反应液B：60µmol／L L一谷氨酸 + 1.6µmol／I NAD + 360µmol／L Tris-HC1缓冲液。
1 mL酶提取液+2 mL反应液B，以加反应液A为对照于340 nm处比色，每隔30s记录一次0D值，直至读数稳定。（参考张智猛，张威，胡文广，矫岩林，王磊，李伟芳的《高产花生氮素代谢相关酶活性变化的研究》）
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在等待中蹉跎岁月不如在失败中寻找出路
2楼2012-08-22 23:35:01
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